[发明专利]在酵母中生产L－乳酸的方法与材料

说明书

本申请要求对2002年5月30提交的美国临时专利申请号60/384,333的优先权。

本发明得到了美国政府的支持，由能源部资助，合同号为DE-FC-36-00GO10598。美国政府在本发明中有一定的权利。

发明背景

乳酸具有广泛的工业适用性，包括在化学加工和合成、化妆品、制药、塑料和食品生产中的用途。大多数工业规模的生产乳酸的方法都是发酵法。这些发酵方法使用不同的产乳酸细菌。

最近的研究探索了重组酵母株在乳酸发酵方法中的用途。重组酵母与细菌发酵相比可能有几个优点。一些酵母株更能耐受较高的温度。这可能允许更高温度的发酵，这可以翻译成更快的发酵速度。对高温的更好的耐受性能够使清除发酵培养基的污染微生物变得更加容易，因为只需将培养基加热到希望的种能够耐受而不希望的种死亡的温度。产乳酸细菌，如乳酸杆菌，其高效生产需要复杂的发酵培养基。发酵培养基的复杂性增加了原料的成本，并且使得从培养基中分离乳酸更加困难且昂贵。使用重组酵母，通过使用简化的发酵培养基，提供了降低成本的可能性。

另外，有些酵母株比产乳酸细菌更能耐受降低的pH条件。这可能是一个非常重要的特征，因为当乳酸产生时，发酵培养基的pH自然下降。在常规方法中，必须使用一种碱，如氢氧化钙或碳酸钙，来缓冲培养基，使其pH约为5-8。它中和酸，形成一种乳酸盐。这种乳酸盐在随后的步骤中必须分开，以便以希望的酸的形式回收乳酸盐。因此，需要缓冲发酵培养基导致增加原材料(缓冲剂，一般是硫酸，用来分解乳酸盐)、其它处理步骤(再生游离酸)和废物(最常见的是盐分解步骤产生的碳酸钙)处理等明显的额外费用。如果发酵能够在低pH下进行，则这些费用能够明显减少。因此，成功开发能够耐受低pH培养基的产乳酸株是非常希望的。

Porro及同事构建了一种产乳酸酵母，构建方法是将一种外源LDH(乳酸脱氢酶)基因插入酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactic)、T.delbrueckii和Z.bailii种的酵母细胞内，并破坏细胞的天然丙酮酸途径。参见Porro等人，“用于生产乳酸的代谢工程酿酒酵母细胞的研发”，Biotechnol.Prog.1995 May-Jun；11(3)：294-8；Porro等人，“为了由工程酵母大规模生产乳酸，一种代谢途径的替换”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep：65(9)：4211-5；Bianchi等人，“用异源LDH基因转化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克鲁维酵母株的高效同型乳酸发酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5。Porro能够生产一种产乳酸的重组酵母，但是该菌株的表现几乎不足以在任何工业化生产过程中使用。为了获准在工业环境中使用，该菌株必须有良好的乳酸收率(即底物向乳酸的高转化率)和高生产率(即底物向乳酸的快速代谢)。该酵母优选地能够耐受含有高滴度乳酸的培养基。

最近，Rajgarhia及同事生产了比Porro的酵母显示更高收率和生产率的重组酵母。参见，例如WO 00/71738、WO 02/42471和PCT/US02/16223。然而，希望产生收率和/或生产率进一步提高的重组酵母。具体而言，希望产生一种重组酵母株，它在有利于乳酸生产的厌氧和/或微需氧条件下以良好的收率和生产率产生乳酸。

发明概述

一方面，本发明是将外源乳酸脱氢酶基因整合到酵母细胞内的一种方法，其中在整合之前，该细胞在其基因组的一个基因座处具有一个靶定的基因，该方法包括下列步骤：(a)用一种重组核酸转化该细胞，该核酸含有乳酸脱氢酶(LDH)基因、LDH基因上游(即5’)和下游(即3’)的侧翼序列和至少一个选择性标记基因，该侧翼序列与靶定的基因上游和下游的侧翼序列同源，其中LDH基因插入细胞基因组内，与靶定的基因的基因座相邻，(b)通过在选择剂存在下培养转化细胞，获得第一种转化细胞，其含有LDH基因和选择性标记基因，(c)在非选择性培养基中培养所述第一种转化细胞，和(d)由所述第一种转化细胞获得第二种转化细胞，其含有LDH基因，但是删除了选择性标记基因和靶定的基因。在优选的酵母细胞中，靶定的基因有利地是丙酮酸脱羧酶(PDC)、醇脱氢酶(ADH)、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(ura3)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)。