[发明专利]检测乙型肝炎病毒DNA及其G1896A突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种利用锁核酸和分子信标技术检测野生型及G₁₈₉₆A突变型的乙型肝炎病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括：(1)血液标本中乙型肝炎病毒DNA提取试剂；(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)突变型阳性对照；(5)野生型阳性对照；(6)阴性对照，其中(2)由10×PCR缓冲液、dUTPs、正反向两条引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)、野生型和突变型分子信标探针(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)及MgCl₂等组成；(3)由普通Taq酶和UNG酶组成；(4)是经过测序确认过的含G₁₈₉₆A突变的HBV DNA片段的质粒；(5)是经过测序确认过的含1896位点未突变的野生型HBV DNA片段的质粒；(6)是高压灭菌水；

其中，用于聚合酶链反应的正向和反向引物序列分别是：

5’-TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3’(SEQ ID NO：2)

用于聚合酶链反应的野生型和突变型分子信标探针序列分别是：

5’-FAM-CAACGCTTTAGGCCATGGACGTTG-DABCYL-3’(SEQ I D NO：3)

5’-HEX-CAACGCTTTGGGCCATGGACGTTG-DABCYL-3’(SEQID NO：4)

其中下划线标记的碱基是进行了LNA化的。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的DNA提取试剂包括由40％PEG8000组成的提取液A、由0.25M NaOH组成的提取液B和由0.4M Tris-HCl，pH6.4组成的提取液C。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的酶混合液由普通Taq酶(5U/μl)和UNG酶(1U/μl)按v/v＝5∶1的比例组成。

4.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的聚合酶链反应混合液每人份由2.5μl10×PCR缓冲液、0.2μl dUTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP各25mM)、浓度均为100μM的正反向两条引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)各0.1μl、浓度均为100μM野生型和突变型分子信标探针(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)各0.1μl及1.5μl MgCl₂(25mM)组成。

5.根据权利要求1或5的试剂盒，其中10×PCR缓冲液是由850mM KCl、400mM Tris-Cl(pH8.9)及50％(v/v)甘油组成。