[发明专利]检测乙型肝炎病毒DNA及其G1896A突变的方法及试剂盒

说明书

发明领域

本发明涉及检测野生型及G₁₈₉₆A突变型的乙型肝炎病毒DNA的方法，特别是涉及一种使用锁核酸(LNA，LockedNucleic Acids)和分子信标探针结合的技术进行实时PCR的检测方法。本发明还进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。

发明背景

病毒性乙型肝炎(HB，hepatitis B)是一种世界性的传染性疾病(Lok AS，Heathcote EJ，Hoofnagle JH.Gastroenterology2001；120：1828-1853)。我国是HBV感染的高发区，约50-70％的人群受过HBV的感染，约8-12％的人群为慢性HBV感染者。目前全世界每年约有120万人死于HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病毒感染不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化(liver cirrhosis，LC)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生、发展有密切的关系。

临床上HBeAg转阴以及HBeAb阳性常常被认为是HBV病毒复制减少、肝损伤和肝癌危险性减轻以及治疗可以终止的指标。然而近期发现，许多患者尽管HBeAg是阴性的，但病毒仍大量复制，肝损伤程度也很严重(即所谓的HBeAg阴性慢性乙型肝炎)。近年来的临床与基础研究均表明，HBeAg阴性慢性乙型肝炎在慢性乙型肝炎患者中所占的比例逐年增大，其在临床表现、预后、抗病毒治疗方案与应答等诸多方面与HBeAg阳性慢性乙型肝炎存在着显著差异。研究表明，HBeAg阴性慢性乙型肝炎是由于HBV基因组发生变异引起的。

HBV基因组共含有4个基因区，分别为S，C，P，X基因区，每个基因区构成一个独立的开放阅读框(ORF，open reading frame)。C基因区又包括两部分：前C(pre-C)区和C区。HBeAg是C基因区的表达产物，该基因区的5’端发生突变常导致HBeAg分泌量的减少，且最常见的突变有两种：一是C基因启动子处的1762(A→T，A₁₇₆₂T)和1764(G→A，G₁₇₆₄A)双突变(Okamoto H，Tsuda F，Akahane Y，Sugai Y，Yoshiba M，Moriyama K，et al.J Virol 1994；68：8102-8110)，该突变导致了转录因子结合的改变(Buckwold VE，Xu Z，Chen M，Yen TS，Ou JH.J Virol 1996；70：5845-5851 and Li J，Buckwold VE，Hon MW Ou JH.J.J Virol 1999；73：1239-1244.)，以至于前C区mRNA的减少，从而减少了HBeAg的合成；二是前C(pre-C)区的1896位点(G→A，G₁₈₉₆A)发生的突变，该突变导致该区第28个密码子成为终止密码子，使得HBeAg的翻译提前终止，从而也减少了HBeAg的合成。有证据表明，HBeAg阴性突变体的主要原因(占60-80％)就是由于pre-C区的1896位点(G→A，G₁₈₉₆A)发生突变引起的(Carman WF，Jacyna MR，Hadziyannis S，Karayiannis P，McGarvey MJ，Makris A，et al.Lancet 1989；2：588-591)。

近期研究又发现，pre-C区的G₁₈₉₆A突变主要发生在HBV的B、C和D型标本中，可能与急性肝炎的发生相关(Annie Pang，Man-Fung Yuen，He-Jun Yuan，Ching-Lung Lai，Yok-Lam Kwong，Journal of Hepatology 2004；40：1008-1017)。又有证据证明pre-C区的G₁₈₉₆A突变是与HBV的持续性感染以及原发性肝癌的发生有关。然而，不管G₁₈₉₆A突变是与急性肝炎的发生还是与HBV的持续性感染相关，它的检测在抗乙型肝炎病毒的诊疗、预后及病毒自然史的研究中都有着十分重要的指导意义。