[发明专利]一种用于蛋白质含量差异测定的方法

说明书

技术领域

本发明一种用于蛋白质含量差异测定的方法属于一种蛋白质相对含量的测定方法，具体来说是一种通过核酸标记蛋白质反应、抗原抗体反应、酶连接反应、核酸扩增反应和实时测序反应来测定不同来源的蛋白质相对含量。

背景技术

人类基因组计划因毛细管阵列电泳测序技术的发展得以提前完成(Anal Chem 74(1):22A，2002)。像毛细管阵列电泳一样，二维电泳技术特别是色谱-质谱联用技术的发展，也大大加快了蛋白质组学的研究步伐(Lambert，J.P.，M.Ethier，et al.Anal Chem 77(12):3771-87，2005)。但蛋白质分子要比DNA分子复杂得多，要在分子水平上阐述表达量极低的蛋白质在生理过程中所扮演的角色，就必须有相应的高灵敏和高专一性的检测方法。蛋白质检测和DNA检测不同，对DNA检测来说，可以采用成熟的核酸扩增技术(如PCR)使微量的DNA扩增(Saiki，R.K.，S.Scharf，et al.Science 230(4732):1350-4，1985)，理论上可以检测到单个分子的DNA，而且特异性也很好；但对蛋白质检测来说，不能采用扩增技术使目的分子的数目增加，而是采用直接测定法，因此其检测灵敏度受到极大限制。如果能用一种类似于PCR的扩增技术扩增蛋白质分子，那蛋白质的检测灵敏度就会大大提高，这对分析单细胞中蛋白质的变化及检测与疾病发生发展相关的蛋白质标志物有重大的意义，可以实现疾病的早期诊断，对重大疾病如肿瘤起到预警作用。

ULF Landegren研究组提出了一种新的蛋白质体外分析方法，称为邻位连接法(Proximity Ligation Assay)(Fredriksson，S.，M.Gullberg，et al.Nat Biotechnol 20(5):473-7，2002)。该方法通过一种高度专一的DNA适配器与蛋白质的亲和机制，将含有不同序列的两条DNA适配器同时结合在待测细胞因子血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)上，两条DNA适配器的主要部分序列相同，仅尾部单链序列不同，分别是DNA序列的3’端和5’端，如果待测样本中含有目的蛋白PDGF-BB，适配器就会与之结合，当两条不同的适配器与同一PDGF-BB分子结合后，适配器尾部的两条单链就相互靠近，易于与互补连接序列杂交，在DNA连接酶的作用下，发生连接反应，采用实时荧光PCR法扩增和检测连接产物，使蛋白质的检测转变为对DNA的检测，实现了痕量蛋白的分析，其检测灵敏度是酶联免疫吸附法(ELISA)的1000倍，能检测到24000个PDGF-BB分子。但实验证明在同一蛋白质分子上同时连接两种不同的亲和探针的几率不高，仅有1/25；更重要的是目前能够用于该方法的DNA适配器种类有限，大大限制了该技术的应用。为此，Gullberg等改用多克隆抗体(McAb)或单克隆抗体(PcAb)代替DNA适配器进行测定，成功分析了11样品中的飞摩尔级的细胞因子(Gullberg，Gustafsdottir et al.Proc Natl Acad Sci USA 101(22):8420-4，2004)。但测定背景较大，限制了灵敏度的进一步提高。Schallmeiner等采用三条邻位探针法使检测背景下降，可以检测到100个分子的蛋白质(Schallmeiner，E.，E.Oksanen，et al.Nat Methods4(2):135-7，2007)。Soderberg等还将该法与滚环扩增方式相结合，用于蛋白质的原位分析，检测细胞中的蛋白质分布情况(Soderberg，O.，K.J.Leuchowius，et al.Genet Eng(NY)28:85-93，2007)。但该方法依赖于实时荧光PCR定量，需要昂贵的实时荧光PCR仪，要作标准曲线，测定繁琐，更重要的是一次仅能测定一个样本，如果用于比较某种蛋白质在三种不同的组织或三种不同的细胞中的表达量差异，就需要分别测定三次，然后再比较分析，因此，不是比较方便有效的检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足之处，采用核酸标记蛋白质反应、抗原抗体反应、酶连接反应、核酸扩增反应和实时测序反应来定量测定同一种蛋白质在多个不同组织或细胞中的表达量差异，建立一种无荧光标记的高灵敏度蛋白质表达差异的检测技术，用于比较蛋白质组学的研究。