[发明专利]流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞分析检测领域，尤其涉及运用流式细胞术检测肿瘤细胞蛋白的表达。

背景技术

目前，在实体肿瘤研究中，由肿瘤组织块制备的单细胞通常全部视为肿瘤细胞进行测定和研究，当需要做患者自身肿瘤细胞与正常细胞比对时，常需要另外采集正常组织细胞，这涉及患者意愿、多部门配合、样品存储运输等系列问题，往往不易完善；在比较肿瘤细胞与正常细胞的蛋白表达水平时，则要在不同的试管中分别检测、分别分析。

事实上在肿瘤组织中除大量的肿瘤细胞外还含有血细胞、血管内皮细胞等正常细胞。如果能用合适的标记抗体加以区分，就可以在一个试管中完成不同细胞的某种蛋白表达水平测定，达到同步检测、同步分析、互相比较的目的。

流式细胞术是借助流式细胞仪通过抗原、抗体反应和荧光标记法完成对细胞各种特性进行定性定量的一种分析技术。其原理是将悬浮在液流中的单细胞逐个通过测量区，用仪器检测细胞的光学参数而达到快速、大量地测定细胞的一系列物理特性和生化特性。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种采用流式细胞术检测肿瘤中细胞蛋白表达的方法，可满足同步测定多种细胞(两种或以上的细胞)的蛋白表达水平的要求。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明的思路是将使用荧光标记区分不同细胞的方法与使用抗体标记特异性识别蛋白的方法组合，达到同步检测不同细胞上某一蛋白表达的目的。

流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞的蛋白表达方法的具体步骤如下：

1、将新鲜的肿瘤组织制备成单细胞悬液。

2、调节单细胞悬液浓度为±10⁶细胞/100μl。

3、在一个试管中加入步骤2得到的单细胞悬液，分别按荧光标记抗体的试剂说明的配比浓度加入能够区分不同待测细胞的荧光标记抗体5-20μl，充分混匀，室温避光反应15～45分钟。通过加入适合的荧光标记与细胞反应显色来区分不同细胞的方法为本领域公知的技术，例如使用具有不同荧光标记的抗体CD3、CD19和CD14同时区分T细胞、B细胞和单核细胞。

4、在上述试管中，加入待测蛋白的荧光抗体，充分混匀，室温避光反应15～45分钟。该抗体的颜色标记要与步骤3中标记细胞的荧光颜色相区别。对于不同的蛋白种类，选择合适的抗体和抗体的加入方式为本领域公知的技术，对于位于细胞膜表面的表达蛋白，可以直接加抗体反应；对于位于细胞内的表达蛋白，需要先对细胞进行固定、破膜，然后加抗体反应。例如检测细胞膜上的多药耐药糖蛋白Pgp表达，直接加与细胞荧光不同的荧光抗体进行反应；在检测细胞核内的凋亡蛋白Bcl-2、增殖细胞核抗原PCNA时，需要先对细胞进行固定、破膜，然后加与细胞荧光不同的荧光抗体进行反应。

5、离心去除上清液，以清除未结合的荧光标记抗体。

6、悬浮细胞后上流式细胞仪检测、分析多种细胞的蛋白表达。

其中步骤3中所述的待测细胞为肿瘤细胞、基质细胞、血管内皮细胞、浸润淋巴细胞或血细胞中的两种或两种以上的细胞。肿瘤细胞可以是鳞癌细胞、腺癌细胞、未分化癌细胞、肉瘤细胞或肿瘤干细胞。血细胞可以是淋巴细胞、单核细胞、粒细胞或造血干细胞。

在肿瘤组织制备成单细胞悬液前，新鲜肿瘤组织块可放入含30-60IU/ml抗凝剂的生理盐水中，以达保湿运输的目的。

有益效果：本发明的流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法与现有技术相比具有如下优点：

1、可以了解肿瘤组织块中不同细胞的含量。

2、以往视肿瘤组织块细胞均为肿瘤细胞进行测定和研究，现在通过标记抗体区分细胞后，可以有效提高对目标细胞测定的准确度和精确度。

3、可以用肿瘤组织块中已有的正常细胞作为内参照，不仅解决了参照细胞不易获取的问题，而且可以在同一张数据图中进行同步分析，扩大了信息量。

4、降低测定成本，减少分次实验带来的系统误差。

附图说明

图1为采用本发明方法检测腺癌样本(实施例1)的流式细胞分析图。

图2为采用本发明方法检测鳞癌样本(实施例2)的流式细胞分析图。

图3a为采用传统方法即不进行细胞标记检测甲状腺肿块样本(实施例3)的流式细胞分析图。

图3b至3e为采用本发明方法检测甲状腺肿块样本(实施例3)的流式细胞分析图。

具体实施方式

实施例1：对腺癌进行抑癌基因突变产物P53(mutant)表达水平的研究。