[发明专利]基于分子结构快速筛选环境有机污染物雄激素的方法

说明书

技术领域

本发明属环境科学研究中环境内分泌干扰物的筛选方法领域，具体地说是基于分子结构来判定含有类苯环类有机化合物是否具有环境雄激素活性的一种快速筛选方法。

背景技术

1998年，EPA提出了内分泌干扰物筛选计划EDSP(endocrine disruptorscreening program)，即用分段式方法(包括分类(sorting)、优先设定(prioritysetting)、第一级筛选(T1S)及第二级检测(T2T)4阶段)来判断化学物是否有可能对人或野生动物有内分泌干扰作用。其中第二阶段优先设定相当于“海选”，我们须在此阶段利用某种方法将大部分化学物排除，筛选出少数有潜在内分泌干扰活性的化学物则进入下一阶段试验。而目前完成此项任务主要是通过实验室的方法。

1、报告基因试验方法

报告基因技术通过把已确定的顺式调控序列剪接到报告基因上形成嵌合基因来控制基因的活性，从而使报告基因对宿主细胞中基因调控和表达的变化起反应，在调控序列控制下进行表达，利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。雄激素受体(AR)是转录调控超家族成员之一，结合配体(雄激素)后转移到细胞核内，同核内靶基因上的雄激素反应元件(androgen responsive element，ARE)相结合调控基因表达。环境抗雄激素作为雄激素受体拮抗剂，能干扰雄激素受体的转录调控作用。将报告基因质粒和AR表达质粒转染人不能表达AR的细胞(如HepG2，CHO等)中，则该细胞中的荧光素酶的表达受AR的调节，测定报告基因表达产物的活性即可以间接地估计报告基因的转录活性及雄激素受体的转录调控作用，雄激素与细胞株作用可剂量依赖性地诱导荧光素酶的表达，同时加入抗雄激素化学物则可以抑制荧光素酶的表达，从而使报告基因技术应用于环境抗雄激素的检测和筛选。

2、非放射性内分泌干扰物结合试验方法

该试验主要用非放射性方法(具体尚未阐明)检测受试物与人胸腺癌细胞和前列腺癌细胞雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)的结合力，将这两种细胞接种、固定和渗透在同一张微孔平板(如384孔平板)上，解决了结果的不稳定性问题并实现了方法的高通量。在特殊的培养条件下诱导细胞的激素受体水平，联合运用化学发光法，可在无同位素标记下对低受体结合力化学物进行检测。

3、重组酵母筛选方法

典型的重组酵母方法是将感兴趣的受体转入酵母，同时转入与易于测量的报告基因相关联的激素反应元件，给予外源性化学物后通过测量报告基因的表达来检测化学物活性。目前，大部分酵母方法集中于雌激素和雄激素样内分泌干扰物的研究。该方法好处在于易培养并可以产生稳定的带有感兴趣的受体、报告基因的转化体。另一个优势是酵母没有内源性的类固醇和甲状腺激素及受体，避免了内源性激素对试验结果的干扰。同时，酵母的代谢能力有限，一旦同时存在母体化学物和代谢产物，可以筛选出活性化学物，也很适合高通量筛选。

4、细胞转染实验方法

细胞转染实验是目前研究较多的方法之一，与酵母筛选类似，将激素受体和相关激素调节的报告基因瞬时或持久转染入哺乳动物细胞，通过测量报告基因反应来检测化学物的激素样活性。典型的转染试验可以分为两类。第1类，将含有受激素反应元件转录控制的报告基因质粒转入细胞，如果细胞无内源性受体或内源性的受体不能有效地进行反式激活，还要转入一个相关的激素受体表达载体。第2类是转入嵌合体受体载体和报告基因质粒，常用的嵌合体系统是Gal42HEG0结构。

虽然实验室筛选环境雄激素的方法已经有很大的发展，也实现了相对高通量的筛选，但其费用、人力和物力的成本还是很高，而且周期长，仍然无法满足每年新增数10万种化学物质这样海量筛选的需要。因此，研究开发新的快速筛选方法已成为当前该领域的重点之一。我们发明采用QSAR模型基于分子结构快速筛选环境有机污染物雄激素的方法，既省时又省成本。

定量结构-活性关系(Quantitative Structure-Activity Relationship，QSAR)是指化学品的分子结构与其生物活性之间的内在的定量关系。

文献检索的结果表明：在本发明完成之前，未发现采用QSAR模型基于分子结构来对环境有机污染物雄激素活性的快速筛选方法。环境有机污染物雌激素活性基于分子结构的快速筛选方法(CN200610097362.2)，其发明的主要内容为利用所发明的模型对有机污染物进行雌激素活性的判断。但雄激素与雌激素分属于两类化合物，判断的基础是完全不一样的，其筛选方法是无法用于雄激素的。

发明内容