[发明专利]木薯体细胞胚胎发生再生植株快繁方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及到一种植物的组织培养方法，具体地说是一种通过生物技术达到木薯良种快速繁殖和规模化生产的方法。

二、背景技术

技术实用性分析：

木薯(Manihot esculenta Crantz)是大戟科(Euphorbiaceae)植物，染色体数为2n＝36，多年生灌木，高1～5m。木薯是仅次于水稻、玉米、高粱的第四大热带作物，其块根含有丰富的淀粉，既可作粮食，也可作为工业原料或饲料，是热带、亚热带地区6亿人的主要粮食来源。木薯起源于南美，于16～18世纪传入非洲、亚洲及大洋洲。现在木薯已广泛地分布于全球的热带及部分亚热带地区。木薯于1820年前由东南亚华侨引入我国，至今已有180多年的栽培历史。目前我国木薯产区包括海南、广东、广西、福建、云南等省区，四川、贵州、湖南、江西等地也有种植，现有栽培面积50余万公顷，鲜薯产量1000万吨。木薯主要的优点是具有很高的产量潜力。它是一种C3-C4中间型作物，在适宜的条件下具有很高的光合作用效率，而在干旱和高温的胁迫下，也能保持较高的光合效率。

木薯历来采用茎段繁殖，繁殖率低，种茎运输量大，种茎埋土过冬又常受寒害，一些高产或抗病品种材料的生产与供应，要在很短的时间内大规模发展是很困难的。由于木薯自身的特性(如植株的高度杂合、花粉育性低、有性子代严重分离等)及种质资源的局限性(如抗性基因资源贫乏、已知的品种均含有氰化物等)，传统的育种方法在木薯上受到限制。组织培养是木薯生物技术的基础，木薯组织培养不仅在快速繁殖及种质保存方面具有重要意义，木薯基因工程(如转抗病、抗虫基因，与产量、品质有关的基因等)也有赖于组织培养技术获得突破。木薯组培的早期工作主要是分生组织培养，即所谓的非不定芽再生途径。再生植株来源于高度联系的多细胞团，如茎尖及侧芽，该方法用于种质资源的保存和交换，品种的提纯、复壮、脱毒等。

自上世纪70年代以来，研究者们利用芽殖方法、木薯茎段诱导愈伤组织，或从木薯幼叶分离出原生质体诱导愈伤组织并获得再生植株^[1-3]，实验结果一直没有得到重复。1982年，Stamp和Henshaw以木薯合子胚的子叶和胚轴为外植体成功诱导出胚状体^[4]。1993年Raemakers从6个木薯基因型的幼叶中诱导出初生体胚，并获得再生植株。这是木薯体细胞发生的突破，但是成熟胚状体的成苗频率很低，且根的发育不全^[5]；Li等在前人工作基础上发展了体细胞胚子叶切割，成功地诱导高频率器官发生并获得再生植株^{[6，7，9，10]}；Zhang Peng报道了AgNO3有促进器官发生的作用，而麦芽糖与蔗糖是优先选择的碳源^[9.13]。但是有关如何利用体细胞胚胎发生快速繁殖基因型的技术并无专门的论述，也未见相关国际专利。

在国内，马国华等(1999)从木薯幼叶诱导体胚和形成器官，其植株再生频率仅为23.4-26.1％^[8]；李洪清等(2000)在研究木薯品种Col12胚状体子叶器官发生和植株再生发现，最佳的器官发生频率达到64％，植株再生系数为5.7倍^【11】；杭玲(2001)等对木薯腋芽分生组织培养产生丛生芽进行了尝试，芽的切割增殖系数达到3.8^[12]；莫饶等(2003)以木薯茎段作为外植体进行快速离体繁殖研究，木薯芽发生频率达到85％以上，芽生根率100％，但试管苗直接移栽成活率只有20％，而经过适度练苗的成活率可以达到80％^[13]。朱文丽等(2006)利用华南8号等7个木薯基因型对木薯茎秆芽殖和利用叶片、腋芽和顶芽为外植体通过体细胞胚胎发生产生高频率再生植株的技术进行了系统的比较筛选^[14]，针对体细胞胚胎发生和离体快繁两个方面，完善了木薯体细胞胚胎发生体系和离体快繁体系：①建立了木薯体细胞胚胎发生再生植株的培养体系，同时证明该培养体系在多个基因型间具有通用性。②建立适合多个基因型木薯快繁体系，利用基础培养基在大多数基因型中获得良好的离体繁殖效果，每个继代周期4-5周，扩繁系数5-7倍，每株试管苗在一年可以繁殖1.5万株。③提高了木薯大田移栽成活率，炼苗移栽成活率达到90％以上，为木薯新品种的快速推广利用提供技术基础。

本发明专利的新颖性可以归纳为：