[发明专利]虫荧光素酶

说明书

本申请是申请日为1995年3月22日，申请号为95193259.4，发明名称为“虫荧光素酶”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及新的具有虫荧光素酶活性的蛋白以及编码及表达该蛋白的DNA和载体。具体地说，本发明提供了在30℃以上时具有热稳定性的虫荧光素酶。

萤火虫荧光素酶在ATP、Mg²⁺和分子氧存在时，催化荧光素的氧化反应，结果产生光。该反应具有约0.88的量子产率(见德鲁加和麦克埃里(1978)以及塞利格尔和麦克埃里(1960))，并且其发光特性可以用于测量ATP水平的光度分析中。

虫荧光素酶可以从昆虫(如萤火虫)体内直接获取，或者通过含有编码该酶的重组DNA构建体的微生物表达获得。可以从四种值得注意的萤火虫中获得该酶或编码该酶DNA，它们是日本的GENJI和HEIKE十字萤火虫(Luciola cruciata)和横纹萤火虫(Luciola lateralis)，东欧的明格列尔萤火虫(Luciola mingrelica)和北美的螟萤火虫(Photinuspyralis)。夜光萤火虫(Lampyris noctiluca)是该酶的另一来源，它的虫荧光素酶的氨基酸序列有84％与螟萤火虫的同源。

野生型和重组型的虫荧光素酶的热稳定性表现为当它们暴露于约30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性。这样的不稳定性不能满足该酶在高温环境下使用或保存，或通过加热提高反应速度的要求。已知日本萤火虫荧光素酶可以通过在217位用一个异亮氨酸残基取代一个苏氨酸残基引起突变来使其在热失活反应中保持稳定(Kajiyama&Nakano(1993)生物化学32 13795-13799页)。通过这种方式，增加了该酶的热稳定性、pH稳定性以及比活。螟萤火虫和明格列尔萤火虫荧光素酶的热稳定化尚未见报道。

本发明提供了新的虫荧光素酶，它们具有比野生型虫荧光素酶更高的热稳定性，这是通过用其它氨基酸，特别是赖氨酸和精氨酸，取代分别存在于螟萤火虫、明格列尔萤火虫、横纹萤火虫和十字萤火虫中的保守序列中的一个谷氨酸残基完成的。该谷氨酸残基位于螟萤火虫荧光素酶的第354位，即保守氨基酸序列TPEGDDKPGA的第三个氨基酸，这个序列发现于该种和其它种萤火虫的虫荧光素酶中。

因此，本发明的第一个方面，是提供了一种具有虫荧光素酶活性的蛋白，并且其氨基酸序列60％以上与螟萤火虫、明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫的同源，该序列的特征在于相应于螟萤火虫虫荧光素酶第354残基和明格列尔萤火虫、十字萤火虫和横纹萤火虫虫荧光素酶第356残基的氨基酸残基不是谷氨酸。

该氨基酸可以是一个天然存在的氨基酸，或是一个所谓罕见氨基酸(unusual amino acid)，例如修饰的天然存在的氨基酸或其类似物。除谷氨酸以外的氨基酸类似物应被理解为那些同与它们类似的氨基酸对蛋白有相同功效的化合物。典型的罕见氨基酸列于美国和欧洲专利手册和专利案件实施细则：包含核苷酸和/或氨基酸序列的申请公开：修饰的和罕见的氨基酸。

优选的蛋白的特征在于：它包含一个氨基酸序列XGDDKPGA其中X不是谷氨酸。更优选的蛋白包含氨基酸序列TPXGDDKPGA，并且出于热稳定性考虑，优选的X是除天门冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸以外的其它任何氨基酸；更优选的是色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或天门冬酰胺，但最优选的是赖氨酸或精氨酸，或它们中任何一个的类似物。