[发明专利]一种高效诱导提取四种紫杉烷类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效诱导提高红豆杉新鲜枝叶中紫杉醇及其半合成前体物质含量的方法。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，图1)是具有五甲基十五碳烯骨架的二萜类化合物，是最早从太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中提取出来的一种天然抗癌药物(Wani etal.，1971)，能与微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的增殖(Kelling et al.，2003；佘琨等，2001)1992年被美国FDA正式批准为抗癌新药，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的作用。近年来研究表明，紫杉醇对治疗其它疾病也有一定潜力，如恶性黑色素瘤(罗士德等，1994)、类风湿性关节炎(Oliver et al.，1994)和早老性痴呆(Burke et al.，1994)等。随着国际市场上对紫杉醇需求量的日益增长，野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏，人工种植红豆杉已成为解决紫杉醇原料短缺的重要途径(刘颖和肖艳，2005；黄玉仙，2005；吉前华，2004)，但如果采用传统方法，从红豆杉树皮中提取紫杉醇，资源耗费太大且人工种植周期长，仍不能解决紫杉醇的原料问题。

目前供临床使用的紫杉醇主要从红豆杉树皮中提取。紫杉醇在红豆杉植物中含量很低，即使当前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有0.01％～0.03％。为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾，多年来科学工作者在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了不懈的努力。人们从以下几个方面进行了研究：红豆杉细胞大规模培养、全合成和半合成、产紫杉醇真菌的筛选和发酵培养，紫杉醇生物合成途径中关键酶基因的克隆和工程菌的改造等。

紫杉醇结构复杂，化学合成难度较大。1988年Denis等报道了以10-去乙酰基巴卡亭III为原料半合成紫杉醇。但是由于合成路线比较复杂，目前尚无商业应用的价值。虽然已发现了一些生产紫杉醇的真菌，但是合成紫杉醇的能力极低，尚无发酵生产的价值，菌种选育、改良工作有待深入进行。

目前，人工种植的红豆杉数量逐渐增加，给紫杉醇的获得提供了新的来源，但是红豆杉生长缓慢，环境适应性较弱，不能依靠人工种植红豆杉的树皮提取所需的紫杉醇，因此，应该利用其可再生部位——枝叶，对其新鲜的枝叶进行充分的开发利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用红豆杉新鲜枝叶为原料，通过加入各种诱导子，对其进行诱导，从而提高体系中紫杉醇及其半合成前体物质的含量来获得紫杉醇产品的工艺方法。

植物体内有一套防御系统来生成一类抗病蛋白抵御外来病菌、虫害和损伤等不良环境。这些抗病蛋白可用于增加细胞壁强度、形成愈伤瘤、作为一种溶菌酶，以及合成植物抗生素等。本发明充分利用植物抗逆性生理和植物代谢理论，以新鲜的红豆杉枝叶为原料，充分考虑到了新鲜物料中次生代谢产物形成过程中酶的活性，利用物料中含有丰富的紫杉醇半合成前体10-脱乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III，通过人工诱导进行匀浆体系中紫杉醇的生物半合成和游离态紫杉烷的转化，以达到提高活性物质含量的目的，进一步提高原料的利用度。

所述的红豆杉新鲜枝叶，其特征在于其主要来源包括东北红豆杉和南方红豆杉。

按照权利要求1所述的鲜磨匀浆，其特征在于：植物中的大部分生物活性成分存在于细胞壁内，由于细胞壁的屏障作用，减慢了生物活性成分向提取溶剂中转移的速率。采用纯水鲜磨匀浆时，对植物枝叶的细胞壁起到破壁作用，加快了胞内物质向溶剂中的释放。

按照权利要求1所述的酶水解，其特征在于：所用的酶包括：淀粉酶和纤维素酶。在传统的溶剂提取方法的基础上，利用酶反应具有高度专一性的特性，根据植物药材细胞壁的构成成分，选择相应的酶，将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分释放出来，溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取细胞内有效成分的目的。由于植物提取过程中的屏障-细胞壁被破坏，因而酶法提取有利于提高有效成分的提取效率。此外，植物体中成分复杂，其中包括蛋白质、果胶、淀粉等非需要成分，这些成分一方面影响植物细胞中活性成分的浸出，另一方面也影响液体制剂的澄清度，传统的提取方法如煎煮，有机溶剂浸出和醇处理等方法存在着提取温度过高，提取率低，成本高，不安全的缺点，而选用恰当的酶，可通过酶反应较温和地将植物组织分解，加速紫杉烷类有效成分的释放。