[发明专利]可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，其特征是：进行α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNA pYC6/CT-ALDC的构建，获得含有α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母，重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01，该酵母保藏于CCTCC保藏号M207162。

2.根据权要求1所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建过程包括：

根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌ALDC基因序列(L04470)，设计一对特异性引物，在5’端引物和3’端引物分别加上内切酶EcoR I和Bam H I的识别位点，该引物由上海生工有限公司合成，浓度2 OD；

上游5’ACT GAATTC ATGAAACGAGAAAGCAACATT

       EcoR I

下游3’CAT GGATCC TTATTCAGGGCTTCCTTCAGT

       Bam H I

以枯草芽孢杆菌为模板直接进行菌落PCR，94℃变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，PCR产物与T-vector的连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5 α中，提取重组子质粒，获得重组质粒pGM-ALDC，该质粒中含有ALDC基因片段。

3.根据权要求1或2所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：所述的重组质粒DNA pYC6/CT-ALDC的构建方法：将pGM-ALDC和pYC6/CT分别用Eco R I和Bam H I双酶切后再进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α，并将阳性克隆扩增，进行质粒DNA的提取，并进行PCR验证，获得pYC6/CT-ALDC重组质粒。

4.根据权利要求1或2所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：含有ALDC酿酒酵母的获得方法，将pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01：

利用醋酸锂转化法，将HDY-01菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线，将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，30℃每分钟180转摇床培养过夜，测定菌液的OD值，使其稀释至50毫升时OD₆₀₀达到0.4，继续培养2-4小时，将酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1×TE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升1×LiAc/0.5×TE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10分钟，在一无菌离心管中分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，1μg pYC-ALDC DNA，700μl1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，700μl1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，作为对照，30℃反应30分钟，加8μLDMSO原液，混合均匀，40℃水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1×TE洗涤沉淀两次加1mLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清，加入0-100μ L1×TE，稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30℃培养2天。

5.根据权利要求3所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其特征是：含有ALDC酿酒酵母的获得：pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01

利用醋酸锂转化法，将HDY-01菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线，将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，30℃每分钟180转摇床培养过夜，测定菌液的OD值，使其稀释至50毫升时OD₆₀₀达到0.4，继续培养2-4小时，将酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1×TE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升1×LiAc/0.5×TE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10分钟，在一无菌离心管中分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，1μg pYC-ALDC DNA，700μl1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，700μ l1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，作为对照，30℃反应30分钟，加8μLDMSO原液，混合均匀，40℃水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1×TE洗涤沉淀两次，加1mLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清，加入0-100μ L1×TE，稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30℃培养2天。