[发明专利]可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用生物工程方法构建可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的方法。

背景技术：

在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟与否的重要指标，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。随着对α-乙酰乳酸脱羧酶研究的不断深入及其在分子生物学技术上的发展，构建α-乙酰乳酸脱羧酶酶活较高，能迅速将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻，从而降低双乙酰含量、缩短啤酒熟化期的啤酒酵母基因工程菌已成为必然趋势。酿酒酵母体内不含有ALDC，因此，外源引入ALDC

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过基因克隆技术在酿酒酵母工业用菌株中外源引入ALDC，使其参与酿酒酵母体内的代谢途径，降低双乙酰的含量，构建低双乙酰的酿酒酵母基因工程菌株。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，进行α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNA pYC6/CT-ALDC的构建、获得含有α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母、重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01该酵母保藏于CCTCC保藏号M 207162。

所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，所述的α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建：

根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌ALDC基因序列(L04470)，设计一对特异性引物，在5’端引物和3’端引物分别加上内切酶EcoR I和Bam H I的识别位点，该引物由上海生工有限公司合成，浓度2OD；

上游5’ACT GAATTC ATGAAACGAGAAAGCAACATT

       EcoR I

下游3’CAT GGATCC TTATTCAGGGCTTCCTTCAGT

      Bam H I

以枯草芽孢杆菌为模板直接进行菌落PCR，94℃变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，PCR产物与T-vector的连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，提取重组子质粒，获得重组质粒pGM-ALDC，该质粒中含有ALDC基因片段。

所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，所述的重组质粒DNA pYC6/CT-ALDC的构建：将pGM-ALDC和pYC6/CT分别用Eco R I和Bam H I双酶切后再进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH 5α，并将阳性克隆扩增，进行质粒DNA的提取，并进行PCR验证。获得pYC6/CT-ALDC重组质粒。

所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，含有ALDC酿酒酵母的获得：pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01：

利用醋酸锂转化法，将HDY-01菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线，将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，30℃每分钟180转摇床培养过夜，测定菌液的OD值，使其稀释至50毫升时OD₆₀₀达到0.4，继续培养2-4小时，将酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1×TE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升1×LiAc/0.5×TE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10分钟，在一无菌离心管中分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，1μg pYC-ALDC DNA，700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入100μL经过处理的酵母菌悬液，100μg变性鲑精DNA，700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE混合，作为对照，30℃反应30分钟，加8μ LDMSO原液，混合均匀，40℃水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1×TE洗涤沉淀两次(加1mLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清)，加入0-100μ L1×TE，稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30℃培养2天。

这个技术方案有以下有益效果：