[发明专利]一种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法

权利要求书

1.一种测定BCG-CpG-DNA中CpG含量的方法，其特征在于采用高效液相法检测。

2.一种测定未甲基化CpG二核苷酸含量的方法，其特征在于采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶dC为5-甲基胞嘧啶m⁵-dC，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法对修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC含量做测定，并通过修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC检出量的差别而对CpG进行定量。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于用SssI甲基化酶修饰CpG时是在合适的NEBuffer中处理DNA，37℃加入S-腺苷蛋氨酸，每4小时补充S-腺苷蛋氨酸，24小时后用25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，再用24∶1的氯仿∶异戊醇抽提2次。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于检测甲基化修饰程度时，DNA原液和甲基化酶处理过的DNA用限制性内切酶Hpa II处理1小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳60分钟，EB染色。

5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶水解DNA时，取50μl DNA溶液至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，加入30mM pH 5.3的乙酸钠100μl，再加入5μl 20mM硫酸锌以及2 units的核酸酶P1于37℃水浴2小时，之后加20μl 0.5M Tris-Cl调pH至8.5，再加入4.7196 units的细菌碱性磷酸酶于37℃水浴2小时，-20℃保存备用；其中DNA溶液为500μg/ml溶于pH 8.0的TE缓冲液。

6.如权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于利用反相-高效液相法测定DNA水解样品中m⁵-dC含量时的条件为：色谱柱为25cm SupclcosilLC-18-DB C₁₈反相柱；流动相为缓冲液A和缓冲液B，其中缓冲液A为2.5％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH4.0，缓冲液B为8.0％v/v甲醇，0.05MKH₂PO₄，pH4.0；洗脱液为70％甲醇-水；流速为1ml/min；柱温为35℃。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

1)用SssI甲基化酶修饰CpG时是在合适的NEBuffer中处理DNA，37℃加入S-腺苷蛋氨酸，每4小时补充S-腺苷蛋氨酸，24小时后用25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，再用24∶1的氯仿∶异戊醇抽提2次，再分别用乙醚，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤，空气中风干，溶解于TE缓冲液中；

2)检测甲基化修饰程度时，DNA原液和甲基化酶处理过的DNA用限制性内切酶HpaII处理1小时后，用1％琼脂糖凝胶电泳60分钟，EB染色；

3)利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶水解DNA时，取50μl DNA溶液至1.5ml离心管中，沸水10分钟变性后置冰水5分钟灭活，加入30mM pH 5.3的乙酸钠100μl，再加入5μl 20mM硫酸锌以及2units的核酸酶P1于37℃水浴2小时，之后加20μl 0.5M Tris-Cl调pH至8.5，再加入4.7196units的细菌碱性磷酸酶于37℃水浴2小时，-20℃保存备用；其中DNA溶液为500μg/ml溶于pH 8.0的TE缓冲液；

4)利用反相-高效液相法测定DNA水解样品中m⁵-dC含量时的条件为：采用waters 600高效液相色谱仪；色谱柱为25cm Supelcosil LC-18-DB C₁₈反相柱；流动相为缓冲液A22.5分钟和缓冲液B 30分钟，其中缓冲液A为2.5％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH 4.0，缓冲液B为8.0％v/v甲醇，0.05M KH₂PO₄，pH 4.0；洗脱液为70％甲醇-水10分钟；流速为1ml/min；柱温为35℃；检测波长为254nm，280nm，双波长同时检测。

8.如权利要求2-7任一项所述的方法，其中所检测的DNA为BCG-CpG-DNA。