[发明专利]一种未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测方法

说明书

本申请是申请日为2004年4月15日，申请号为200410033878.1，发明名称为“一种免疫佐剂和含有该佐剂的疫苗”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及核苷酸含量的检测方法，具体是涉及未甲基化CpG二核苷酸的含量的检测。

背景技术

佐剂是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐剂方面，虽然铝佐剂的应用已接近80年，其安全性也经过了长期应用的检验，但由于其对细胞免疫作用不明显，尤其对细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人们一直致力于新型佐剂的研究。

CpG-DNA刺激天然免疫，促进抗原特异的体液和细胞免疫，作为疫苗的佐剂已有实验室研究的记载。CpG-DNA疫苗佐剂活性主要体现在以下几个方面：活化APC细胞，上调CD40、CD 54、CD80、CD 86和MHCII类分子等细胞分子的表达，增强抗原呈递能力；作为辅助刺激信号，协同TCR/BCR传入的抗原活化信号，活化抗原特异性的T细胞和B细胞；通过IFN-α/β、IL-12、IL-18等细胞因子诱生Th1类免疫应答；诱生较强的CTL反应。应答的抗体类型以IgG2a为主。但是目前的CpG-DNA研究都是针对人工合成的含CpG基序的寡核苷酸(ODN)，制备成本高，阻碍了临床应用的推广。

细菌提取物是CpG-DNA的另一个来源，但是至今没有关于来自细菌的CpG-DNA作为佐剂的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种来源于细菌提取物的CpG-DNA免疫佐剂，该佐剂本身具有免疫活性，与疫苗中的抗原在体内作用能诱导Th1型为主的免疫应答。

本发明同时提供该免疫佐剂作为治疗和预防用疫苗佐剂的用途和含有该佐剂的疫苗。

本发明的CpG-DNA佐剂是来自提取物细菌，尤其是富含CpG基序的卡介菌提取物。本发明以该卡介菌DNA(BCG-CpG-DNA)做为疫苗佐剂，证实了其诱导的免疫反应特点，以此研制出新型的免疫佐剂。

CpG-DNA是指含有未甲基化CpG二核苷酸基序的DNA，本发明得到的BCG-CpG-DNA是含有未甲基化CpG基序天然的CpG-DNA，它是从细菌中，优选是从卡介菌中提取的。

本发明提供的BCG-CpG-DNA，一个重要的特点就是来自天然产物，其CpG含量可以通过高效液相检测而获得，即，其中的有效成分含量是已知的。其通过以下方法获得：将菌种接种于适合分支杆菌生长的培养基中培养至对数期时收集菌体；菌体经破碎后离心收集上清液；上清液经CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)的沉淀物用NaCl溶液溶解后用有机溶剂抽提收集无蛋白层，该无蛋白层再次抽提后的上清液用乙醇处理收集沉淀，对该沉淀进行后处理。得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量在15.75％-24.75％，优选是在21.5-23.5％，按照本发明具体提取方法得到的BCG-CpG-DNA中CpG的质量百分含量可以达到22.5％左右。

检测CpG含量可以通过反相-高效液相法(RP-HPLC)：采用特异甲基化酶SssI修饰CpG二核苷酸的胞嘧啶(dC)为5-甲基胞嘧啶(m⁵-dC)，利用核酸酶P1和细菌碱性磷酸酶(BAP)将DNA水解为单个脱氧核苷，利用反相-高效液相法(RP-HPLC)对修饰和未修饰的DNA水解样品中m⁵-dC检出量的差别而对CpG进行定量。

根据本发明的另一个方面，就是通过大量试验探索证实，该新型富含CpG基序佐剂本身具有免疫活性，作为佐剂诱导的是Th1型为主的免疫反应，机体产生抗体类型以IgG2a为主，因此该富含CpG基序佐剂能赋予疫苗既能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，在体内诱导Th1型为主的免疫反应的功能，从而发挥疫苗的预防作用及治疗作用。

本发明更提供了一种含有BCG-CpG-DNA作为免疫佐剂的疫苗。该疫苗可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合制备的液体疫苗，也可以是BCG-CpG-DNA与抗原混合后制备的冻干疫苗。即，本发明的这种疫苗可以是BCG-CpG-DNA佐剂与抗原混合而成，也可以是BCG-CpG-DNA与目前的铝佐剂疫苗混合而成。

在本发明提供的疫苗中，该免疫佐剂BCG-CpG-DNA的含量为每单位剂量疫苗中10-250μg/人份，该用量与所用的抗原或疫苗有关。

附图说明

图1为BCG-CpG-DNA佐剂作用不同免疫时间的结果比较，图中：