[发明专利]采用低能N+离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法

权利要求书

1.一种采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其特征在于：其步骤是：

(1).筛分出发菌株：挑取一环枯草芽孢杆菌AS1.398接入种子培养基中，选择酶活较高且较稳定的菌株作为出发菌株；

(2).N⁺离子注入诱变：将枯草芽孢杆菌出发菌株于液体培养基中培养后立即进行N⁺离子注入，将经过N⁺离子注入的培养皿用无菌水洗脱，稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培养；

(3).筛选高产菌株：将经离子束注入后在牛肉膏蛋白胨平板上培养的菌株用无菌水洗下，适当稀释后涂布于酪素筛选平板上，待菌落长成后，视菌落周围透明圈的大小挑选相对菌落小透明圈大的菌落转接到斜面培养基上培养；

(4).N⁺离子注入诱变：将菌液采用最佳注入剂量对菌株进一步诱变筛选，挑取菌落周围透明圈比对照株透明圈大的菌落转接入斜面培养基中，待菌落长成后经摇瓶培养，取发酵液用Folin法测定所产中性蛋白酶的活力，经复筛得到中性蛋白酶活力大于8120U/mL的高产突变株；

(5).中性蛋白酶高产菌株的确定：对以上诱变试验中筛选得到的高产突变株进行连续传代试验，考察其遗传性状的稳定性，最终筛选到作为最终应用于生产上的菌株。

2.根据权利要求1所述的采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其特征在于：所述的N⁺离子注入条件为注入能量为30keV，注入剂量为50×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为10^-3pa，以5s脉冲式注入，间隔为15s。

3.根据权利要求1所述的采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其特征在于：所述的菌液采用的最佳注入剂量为50×10¹⁴ions/cm²。

4.根据权利要求1所述的采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其特征在于：利用涂布平板上菌落周围透明圈的大小来筛选高产菌株，所用筛选培养基为(g/L)：KH₂PO₄ 0.36、MgSO₄·7H₂O 0.5、ZnCl₂ 0.014、Na₂HPO₄·7H₂O 1.07、NaCl 0.16、CaCl₂ 0.002、FeSO₄ 0.002、酪素4、琼脂20。