[发明专利]采用低能N+离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和酶学领域，更具体地，涉及一种采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法。

背景技术

中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。由于其具有催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，但由于此种方法具有局限性，人们越来越多地把目光投入到微生物蛋白酶上。

近些年来，离子束作为一种新的诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展极为迅速。与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换等效应。它将物理诱变与化学诱变特性于一身，能够在低剂量注入的情况下，显著提高生物的变异率，获得损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果。离子注入技术被广泛应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，已选育出一些在工业上具有较大应用前景的生物新品种，并取得了显著的经济效益和社会效益。

目前尚未发现采用离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，可有效提高中性蛋白酶的产量。

本发明采取的技术方案是：

一种采用低能N⁺离子注入技术诱变选育中性蛋白酶高产菌株的方法，其步骤是：

(1).筛分出发菌株：挑取一环枯草芽孢杆菌AS1.398接入种子培养基中，选择酶活较高且较稳定的菌株作为出发菌株；

(2).N⁺离子注入诱变：将枯草芽孢杆菌出发菌株于液体培养基中培养后立即进行N⁺离子注入，将经过N⁺离子注入的培养皿用无菌水洗脱，稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨平板上培养；

(3).筛选高产菌株：将经离子束注入后在牛肉膏蛋白胨平板上培养的菌株用无菌水洗下，适当稀释后涂布于酪素筛选平板上，待菌落长成后，视菌落周围透明圈的大小挑选相对菌落小透明圈大的菌落转接到斜面培养基上培养；

(4).N⁺离子注入诱变：将菌液采用最佳注入剂量对菌株进一步诱变筛选，挑取菌落周围透明圈比对照株透明圈大的菌落转接入斜面培养基中，待菌落长成后经摇瓶培养，取发酵液用Folin法测定所产中性蛋白酶的活力，经复筛得到中性蛋白酶活力大于8120U/mL的高产突变株；

(5).中性蛋白酶高产菌株的确定：对以上诱变试验中筛选得到的高产突变株进行连续传代试验，考察其遗传性状的稳定性，最终筛选到作为最终应用于生产上的菌株。

而且，所述的N⁺离子注入条件为注入能量为30keV，注入剂量为50×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为10^-3pa，以5s脉冲式注入，间隔为15s。

而且，所述的菌液采用的最佳注入剂量为50×10¹⁴ions/cm²。

而且，利用涂布平板上菌落周围透明圈的大小来筛选高产菌株，所用筛选培养基为(g/L)：KH₂PO₄ 0.36、MgSO₄·7H₂O 0.5、ZnCl₂0.014、Na₂HPO₄·7H₂O 1.07、NaCl 0.16、CaCl₂ 0.002、FeSO₄ 0.002、酪素4、琼脂20。

本发明的优点及积极效果是：

1.本发明中的中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AS1.398经过发酵而得，该菌种在经过紫外线、微波、氯化锂及N-甲基-硝基-N-亚硝基呱等传统诱变方法处理后，已导致负突变和抗性饱和，而采用离子注入进行诱变具有上述诱变因子所不具有的优点，它能够打破此瓶颈，获得以目标产物为目的的高产优良菌株。因此，本发明通过低能N⁺离子注入诱变选育中性蛋白酶的生产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，降低了生产成本，并获得良好的经济效益。