[发明专利]保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地涉及一种保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法。

背景技术

DNA分子标记是新兴的分子生物学技术，能够从DNA水平直接反映生物的遗传本质，具有数量多、多态性高、不受季节、环境影响、检测手段简单迅速等多种优点。分子标记已经成为生命科学的前沿领域，广泛应用于生物遗传多态性分析、遗传连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因定位、亲缘关系分析、性别鉴定、基因组作图、基因克隆、文库构建和分子标记辅助选择育种等等多个方面，促进了农业、林业、牧业，以及医学包括法医学等方面的快速发展。

1980年，分子标记RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段长度多态性，Botstein D，White R L，Skolnick M，Davis R W.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragmentlength polymorphisms[J].American Journal of HumanGene-tics，1980，32：314～331)以文献报道形式出现。由于核苷酸序列的改变遍及整个基因组，遗传标记的数量已不再成为限制因素，其优点明显超过经典的蛋白质多态性，从此开创了利用DNA多态性进行分子标记的新阶段。但是RFLP的缺点也很明显：必须经过酶切和DNA杂交，因此，DNA需要量大，检测技术繁杂，难以大范围推广使用，开发新的分子标记技术势在必行。1990年，美国杜邦公司的科学家Williams(Williams J G K，Kubelik A R，LivakK J，et al.DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Usefulas Genetic Markers[J].Nucl Acid Res.1990，18：6531-6535)和加利福尼亚生物研究所Welsh(Welsh J，McClelland M，Fingerprinting genomesusing PCR with arbitrary primers.Nucleic AcidsResearch，1990，18(24)：7213～7218)分别领导的两个小组几乎同时将PCR技术应用于分子标记，发展出一种新型的分子标记技术RAPD(randomamplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。RAPD技术快速、简便，成本低廉。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷：RAPD为显性标记，不能提供完整的信息；易受实验条件影响；稳定性差；结果不能区分纯合体和杂合体。1989年，Tautz提出了SSR(Simple Sequence Repeat，简单序列重复，Tautz D.Hypervariability of simple sequences as ageneral source for polymorphic DNA markers[J].N ucleic Aci dsResearch，1989，17：6463～64711)，又称微卫星DNA(MicrosateliteDNA(Litt and Luty 1989，Litt M，LutyJ A.A hypervariable microsatelliterevealed by in vit2ro amplification of dinucleotide repeat within thecardiac muscle actin gene.A merican Journal of Human Genetics，1989，44：397～4011)。SSR标记是利用其两端特定的DNA序列设计一对引物进行PCR扩增，然后凝胶电泳，数据分析。该技术具有很好的稳定性和多态性，DNA用量少，重复性高。但她的开发和合成新的SSR引物投入高、难度大，必须有大量的前期工作。1991年Moore等(Moore SS，Sargeant LL，King TJ，etal.The conservation of dinucleotide microsatellites among mammaliangenomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closelyrelated species[J].Genomics，1991，10：654～660)创立了SSR即微卫星DNA分子标记。SSR分布广、多态性丰富，但前期开发及合成SSR引物投入高、难度大。SSR标记往往远离功能基因，对研究功能基因不利。由于SSR突变率高，开发出来的引物不能通用。1992年，荷兰学者Zabeau Marc和VosPieter(VosP，Hogers R，BleekerMetal.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Research，1995，21：4407～4414)把RAPD和RFLP技术结合起来，发明了新的分子标记AFLP技术(amplified fragment lengthploymorphism，扩增片段长度多态性)，1993年获欧洲专利局专利，专利号为EP0534858A1(Zabeau M，Vos P.Selective restriction fragmentamplification：a general method for DNA finger printing[P].EuropeanPatent Office Publication 1993，0535858AI.)。该技术快速、高效，分辨率高、重复性好、易于标准化，很快被推广到生物学的各个领域。但也存在明显的缺点：技术繁琐；过程时间长；检测的不是等位片段；费用昂贵；AFLP标记是显性标记，不能提供完整信息。另外，它常常使用放射性同位素，假阳性频繁。1995年，Umethara等(Umethara Y，Inagaki A，Tanou H，YasukochiY，Nagamura Y，Saji S，Otsuki Y，Fujimura T，Kurata N，Minobe Y，Construction and characterization of rice YAC library for physicalmapping.Molecular Breeding，1995，1，79-89)用cDNA作为探针构建水稻染色体的物理图谱，该标记是一种EST标记。2001年，Schubert等(SchubertR，Starck GM，Riegel R(2001)Development of EST-PCR markers andmonitoring their intra populational genetic variation in Picea abies(L.)Karst.Theoretical and Applied Genetics，103，1223-1231)应用EST-PCR分子标记进行了欧洲云杉基因变异的研究。但EST的高度的保守性造成其多态性极低，难以大量应用。1996年，美国MIT的科学家Lander(LanderE S.The new genomics：Global views of biology.Science，1996，274：536～539)提出了SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)。SNP数量极多，其遗传稳定性远高于SSR，可以进行快速、规模化筛查，易于基因分型。和SSR一样，SNP也需要前期工作基础，制作一个SNP图需要多个SNP，且难以确定哪个SNP出错，并对数据进行有效分析。2001年，美国加州大学的Li与Quiros(Li G，Quiros C F.Sequence--related amplifiedpolymorphism(SRAP)，A new marker system based on a simple PCRreaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica.TheorAppl Genet，2001，103：455～461)发表了一种新型分子标记SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)，又叫SBAPsequence-based amplified polymorphism，基于序列扩增多态性)。2003年，美国农部北方作物科学实验室Hu与Vick(Hu J，Vick BA.Targetregion amplification polymorphism，a novel marker technique for plantgenotyping.Plant Mol Biol Rep.2003，21，289-294)在SRAP的基础上又提出了TRAP分子标记，TRAP的一个引物直接应用SRAP，另一个根据EST设计。TRAP和SRAP的优点是操作简便、产量中等、条带易于分离及可测序，操作过程简单，不须使用同位素。但这二种技术存在一个共同缺陷：PCR的起始退火温度过低，假阳性率太高。除第一个分子标记RFLP是基于DNA Southern杂交技术外，后来发展的分子标记基于PCR技术，他们的技术核心是引物的设计。