[发明专利]诱变处理的确认方法及其所用核酸分子

说明书

技术领域：

本发明涉及一种确认检测DNA在一定领域内的胞嘧啶甲基化时进行的诱变处理是否适当的方法及确认所用核酸分子和试剂盒。

背景技术：

在高等真核生物的染色体DNA中，构成DNA的碱基中C(胞嘧啶)的5位常受到甲基化修饰。DNA这种在高等真核生物中的甲基化具有抑制遗传信息表达的功能。基因组DNA中富含CpG的区域(CpG岛、CG岛)多位于基因启动子区。因此，当CpG岛甲基化时，转录基因无法与启动子结合，基因的转录得到抑制。如果CpG岛未被甲基化，则转录因子可以结合到启动子区域，形成基因可转录状态。这种DNA甲基化对基因表达的抑制对早期胚胎发育、组织变异的基因表达、哺乳动物特有现象的基因印记和X染色体失活、染色体稳定化、DNA复制的时机等种种生理和病理现象发挥着重要作用。近年来，人们越来越明白，这种DNA的甲基化强烈地干预癌症和其他疾病。

DNA中未甲基化的胞嘧啶(未甲基化胞嘧啶)通过诱变处理(将胞嘧啶变为其他碱基的处理(比如，让诱变亚硫酸氢盐等碱基的试剂(以下称诱变剂)与DNA接触的处理))可以变成其他碱基。然而，已被甲基化的胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)即使进行诱变处理也无法变成其他碱基。利用这一点，对目的检测标本中的DNA进行诱变处理，用甲基化特异性PCR法(MS-PCR、James G.HERMAN et al.，Methylation-speCifiC PCR：A novel PCR assay FOR methylation status of CpGislands，ProC.Natl.ACad.SCi.USA，Vol.93，pp.982 1-9826，September1996.)检测胞嘧啶是否变为其他碱基。以此可以检测出该DNA的特定区域是否甲基化(甲基化检测)(US6017704)。

诱变处理不适当，则有可能在甲基化检测时得出错误的结果。因此，在进行标本甲基化检测时，最好确认所作诱变处理是否适当

要确认所作诱变处理适当，可以使用已知含未甲基化胞嘧啶的来源于人类基因组的对照DNA(比如CpGenomeTM UniversalUnmethylated DNA(CHEMICON)等)作为质控品。作为确认即使实施诱变处理也不出现甲基化胞嘧啶突变的质控品，可以使用含甲基化胞嘧啶的人类基因组由来的对照DNA(比如：CpGenomeTMUniversal Methylated DNA(CHEMICON)等)。

在进行标本中所含DNA的诱变处理和甲基化检测的过程中，通过上述对照DNA的诱变处理和甲基化检测，可以推测对标本所作诱变处理是否适当。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

上述对照DNA来源于人类基因组，因此与从人体采集的标本混合在同一容器中进行诱变处理和甲基化检测，是无法判别诱变处理后的甲基化检测时检出的甲基化来源于标本和对照DNA中的哪一方。因此，使用有上述人类基因组由来序列的对照DNA时，需要在各自不同的容器内进行诱变处理。然而，使用不同的容器就无法在同等条件下进行诱变处理，从而根据对照DNA的甲基化检测结果无法非常可靠地确认对标本进行的诱变处理是否妥当。

本发明的目的即有鉴于此，提供一种能够比以往更可靠地判别所作诱变处理是否适当的诱变处理确认方法以及确认所用试剂盒。

本发明提供一种确认将采自生物的DNA的未甲基化胞嘧啶变成胞嘧啶以外的其他碱基的诱变处理是否适当的方法，所提供的诱变处理确认方法包括以下步骤：

将从所述生物采集的DNA与在所述生物基因组中未包含的、且含有胞嘧啶的序列A的精度管理用核酸混合的步骤；

将获得的混合液中未甲基化胞嘧啶变为胞嘧啶以外碱基的步骤；

检测所述序列A或上述序列A中的胞嘧啶突变为所述其他碱基序列的序列A’的步骤；以及

根据所述检测结果判断所做所述诱变处理是否适当的步骤。

其中，所述检测步骤用于检测所述序列A和所述序列A’。其中，所述检测步骤用可与所述序列A杂交的多核苷酸和可与所述序列A’杂交的多核苷酸检测所述序列A和所述序列A’。

其中，当所述序列A中的胞嘧啶含未甲基化胞嘧啶、在所述检测步骤中检出上述序列A’时，则所述判断步骤判断上述诱变步骤适当。

其中，当所述序列A中的胞嘧啶含甲基化胞嘧啶、在所述检测步骤中检出上述序列A时，则所述判断步骤判断上述诱变步骤适当。