[发明专利]检测中期因子浓度的ELISA试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.检测中期因子浓度的ELISA试剂盒，其特征在于包括以下组成：

(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

(2)洗涤液为含1％Tween-20的PBS，其成分为PBS，1％Tween-20；

(3)封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA；

(4)加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl，0.5 M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4；

(5)反应终止液成分为2 M H₂SO₄；

(6)包被到酶标板上的鼠抗人MK单克隆抗体母液，浓度为0.5mg/ml；

(7)兔抗人MK多克隆抗体母液，浓度为1mg/ml；

(8)辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体母液，浓度为0.5mg/ml；

(9)大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的His-MK，N端带有6个His标签，其母液浓度为400ng/ml。

2.如权利要求1所述检测中期因子浓度的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤：

(1)在酶标板中加入PBS稀释100倍的鼠抗人MK单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被24小时；

(2)弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5分钟；

(3)每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2小时；

(4)弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5分钟；

(5)将待检样品、100倍稀释的兔抗人MK多抗和1000倍稀释的HRP标记的羊抗兔二抗的混合液，每孔加入100μl，置于37℃湿盒中孵育2小时；

(6)弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤6次，每次5分钟；

(7)每孔加入100μl TMB室温反应10-30分钟；

(8)每孔加入50μl 2 M H₂SO₄终止反应；

(9)在酶标仪中测定OD₄₅₀值；

(10)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制四参数拟合标准曲线；

(11)通过标准曲线和未知浓度样品的OD值计算待检样品中中期因子的浓度。