[发明专利]检测中期因子浓度的ELISA试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及一种ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测方法，具体为一种检测样本中中期因子浓度的ELISA方法。

背景技术

中期因子(midkine，MK)是一个由121个氨基酸组成的分子量约为14kDa的碱性蛋白质，属于肝素结合生长因子家族，最初是从胚胎癌细胞中筛选而得。对它的深入研究发现，中期因子一般在人胚胎中期的肝、肾和大脑中高表达，在健康成人体内表达极微弱，但在各类癌症患者包括食管癌、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌等多种病变组织中又可检测到中期因子的强烈表达。此外，在很多类型的癌症患者血液及尿液中也发现中期因子的浓度升高，而且具有非常高的敏感性和特异性。中期因子在很多方面表现出与肿瘤发生相关的活性，包括促进细胞转化和肿瘤细胞增殖，促血管生成，抗肿瘤细胞凋亡和药物作用等。利用反义寡核苷酸链抑制它的表达能够显著抑制肿瘤的生长。这些研究结果表明中期因子在肿瘤的发生、发展和恶化过程中扮演着极为重要的角色。

ELISA已经成为一种成熟的免疫分析方法，具有特异、灵敏和快速的特点，在临床医学中已经得到了广泛的应用。因此，建立检测中期因子的ELISA方法，在基础研究和临床医学检测方面都有重要的应用价值。

国内目前尚无任何有关检测中期因子浓度的方法或相关报道，更无相关专利。国外有两家公司生产检测中期因子浓度的ELISA试剂盒产品，但成本都很高且操作繁琐、费时。国外的试剂盒采用的方法如下：兔抗人中期因子的多抗包被微孔板，加入标准品和样品与包被的抗体孵育2小时，洗涤数次之后加入生物素标记的抗人中期因子抗体，孵育1小时之后洗涤数次，再加入链霉亲和素偶联的HRP(辣根过氧化物酶)孵育1小时，再经过洗涤之后加入底物显色。也就是每加入一种样品或抗体都要经过1～2小时孵育并洗涤，过程比较繁琐、费时，而且价格很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测程序简便的检测样本中中期因子浓度的ELISA试剂盒及其制备方法。

本发明的目的是通过以下方法实现的：首先构建中期因子的原核表达质粒进行中期因子蛋白的表达和纯化。用纯化的中期因子蛋白免疫新西兰大白兔制备兔抗人中期因子的多克隆抗体。用商品化的鼠抗人中期因子单克隆抗体(上海我武生物技术有限公司，Mab-M052)包被酶标板，封闭后加入待检样品、兔抗人中期因子多抗与HRP标记的羊抗兔IgG二抗共孵育。经过彻底洗涤后加入底物TMB溶液反应显色，最后用硫酸终止反应并在450nm处检测吸光度值。通过标准样品的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线，待检样品中中期因子的浓度就可以通过它的吸光值并对应标准曲线得到。

本发明检测中期因子浓度的ELISA试剂盒包括以下组成：

1、包被缓冲液为磷酸盐缓冲液PBS，其成分为140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH值为7.4；

2、洗涤液为含1％Tween-20的PBS，称为PBST，其成分为PBS，1％Tween-20；

3、封闭液为含1％BSA的PBS，其成分为PBS，1％BSA；

4、加样缓冲液的成分为50mM Tris-HCl，0.5M KCl，1％BSA，0.05％Tween-20，pH值为8.4；

5、反应终止液成分为2 M H₂SO₄。

6、包被到酶标板上的抗体是鼠抗人MK单克隆抗体，其母液浓度为0.5mg/ml，工作浓度为5μg/ml，即稀释100倍使用；

7、兔抗人MK多克隆抗体，其母液浓度为1mg/ml，工作浓度为10μg/ml，即最终稀释倍数为100倍；

8、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体，其母液浓度为0.5mg/ml，工作浓度为0.5μg/ml，即最终稀释倍数为1000倍；

9、大肠杆菌E.coli中原核表达并通过亲和纯化的His-MK，N端带有6个His标签，其母液浓度为400ng/ml，可经过不同倍数的稀释而得到所需的不同浓度的MK标准品。

本发明检测中期因子浓度的ELISA试剂盒的使用步骤如下：

1、在酶标板中加入PBS稀释100倍的鼠抗人MK单克隆抗体，每孔100μl，4℃包被24h；

2、弃去孔中液体，在干净的吸水纸上拍干，并用洗涤液洗涤2次，每次5min；