[发明专利]人白细胞介素-15的生产方法无效
申请号: | 200710162967.X | 申请日: | 2007-09-28 |
公开(公告)号: | CN101165185A | 公开(公告)日: | 2008-04-23 |
发明(设计)人: | 黄阳滨;任军;徐晓燕 | 申请(专利权)人: | 上海新生源医药研究有限公司 |
主分类号: | C12N15/24 | 分类号: | C12N15/24;C12N15/63;C12N15/74;C12N1/20;C12P21/02 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 200031上海市*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 白细胞 15 生产 方法 | ||
技术领域
本发明涉及基因工程领域,更具体地,本发明提供了一种高密度、高效的重组人白细胞介素-15的生产工艺。
背景技术
白细胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子。IL-15是一个多效能细胞因子,低剂量的外源IL-15能诱导NK细胞、NK-T细胞和CD8+记忆T细胞的发育、增殖及活化,提高机体CD8+T细胞的抗肿瘤或抗病原体功能,而不产生明显毒副作用。在IL-15的功能研究中,William Munger等人首先报道了IL-15具有抗肿瘤作用。在肿瘤肺转移模型中比较IL-15与IL-2的疗效时发现,虽然IL-15诱导体内特异性杀伤效应只有IL-2的1/3,但是它诱导的NK杀伤活性比IL-2高3-4倍。在大鼠结肠癌模型中还发现,IL-15能显著降低化疗引起的胃肠道毒性,增加药物的最大耐受剂量。临床研究发现,IL-15可以刺激成年T细胞白血病患者外周血淋巴细胞的增殖,提高34例肺癌患者和20例对照外周血单个核细胞(MNCS)和胸膜腔单个核细胞(MNCS)的NK活性和CTL活性。IL-15可能是治疗实体瘤,尤其是抑制对IL-2有抗性的广谱实体瘤生长的有效候选因子。
本发明人在国内较早开展对IL-15的研究,截至2001年已完成了下述工作:克隆了hIL-15 cDNA,进行了原核及真核表达;构建了转染hIL-15 cDNA的小鼠肺腺癌细胞系LA795A和人肺鳞癌细胞系PG1,并进行了体内致瘤性研究。研究结果显示,LA795A细胞在小鼠体内的致瘤性明显降低,有明显的抑制肿瘤生长作用;PG1细胞在裸鼠体内能够产生抗肿瘤肺转移作用,其抗瘤作用的产生至少为NK和T细胞依赖的。研究还发现IL-15基因修饰瘤苗通过分泌IL-15诱导淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α,提高机体的CTL活性和NK杀伤活性来增强对肿瘤的抑制作用。此外,IL-15基因转染肿瘤细胞后,细胞表面MHC I类分子表达显著降低,对NK细胞的杀伤敏感性大大增强。随后进行的基因治疗研究发现,IL-15裸质粒DNA对T739荷瘤小鼠有明显的早期局部治疗作用,可提高小鼠的存活率,延长存活期,并对防止肿瘤发生有一定的保护作用。此外,研究还发现,IL-15裸质粒DNA治疗后,小鼠脾细胞I类及II类MHC分子表达和CTL/NK细胞毒活性均升高,进一步佐证IL-15是通过促进机体APC细胞的呈递作用增强CD8+T细胞的CTL活性,而且,NK细胞毒的杀瘤作用举足轻重,也是提高肿瘤杀伤能力的关键因素。
以阳性克隆建立原始种子库,该种子库的检测表明无外源因子污染,各项生化指标达到要求,表达水平达到要求。本发明提供了一种重组人IL-15的新型发酵方法,采用大肠杆菌表达体系以包涵体表达,通过优化发酵工艺,整个过程稳定、快速、简便,获得高密度、高表达水平的重组人IL-15。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高密度的重组人IL-15的表达方案。包括用于该方案的培养基及诱导条件。
在本发明的第一方面,提供了一种重组人IL-15的中试生产方法,该方法包括步骤:
a)在适合的表达条件下,在摇瓶中培养如权利要求4所述的表达载体,从而以包涵体形式表达出重组人IL-15;
b)在适合的表达条件下,在5L发酵罐中优化出最佳中试生产方案。
在本发明的二方面,提供了一种工程菌,其特征在于,它含有编码人IL-15的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述的工程菌是大肠杆菌。
附图说明
无。
具体实施方式
本发明人根据人IL-15的氨基酸序列,按照大肠杆菌密码子偏爱性原则,人工合成重组人白细胞介素-15基因的全序列,将它克隆入质粒pET-30a(+),然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经表达筛选获得IL-15高表达工程菌。
发明人通过深入、广泛的研究,通过对重组人IL-15的一系统列优化表达实验,为上罐发酵确定了基本工艺条件;然后该工艺又通过在发酵罐水平(5L)进行了不断地优化与验证,最终确定了本工程菌稳定的发酵工艺,通过表达稳定性研究,获得了能在大肠杆菌表达体系中稳定高效表达的重组人IL-15。在此基础上完成了本发明。
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