[发明专利]人白细胞介素－15的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种高密度、高效的重组人白细胞介素-15的生产工艺。

背景技术

白细胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子。IL-15是一个多效能细胞因子，低剂量的外源IL-15能诱导NK细胞、NK-T细胞和CD8⁺记忆T细胞的发育、增殖及活化，提高机体CD8⁺T细胞的抗肿瘤或抗病原体功能，而不产生明显毒副作用。在IL-15的功能研究中，William Munger等人首先报道了IL-15具有抗肿瘤作用。在肿瘤肺转移模型中比较IL-15与IL-2的疗效时发现，虽然IL-15诱导体内特异性杀伤效应只有IL-2的1/3，但是它诱导的NK杀伤活性比IL-2高3-4倍。在大鼠结肠癌模型中还发现，IL-15能显著降低化疗引起的胃肠道毒性，增加药物的最大耐受剂量。临床研究发现，IL-15可以刺激成年T细胞白血病患者外周血淋巴细胞的增殖，提高34例肺癌患者和20例对照外周血单个核细胞(MNCS)和胸膜腔单个核细胞(MNCS)的NK活性和CTL活性。IL-15可能是治疗实体瘤，尤其是抑制对IL-2有抗性的广谱实体瘤生长的有效候选因子。

本发明人在国内较早开展对IL-15的研究，截至2001年已完成了下述工作：克隆了hIL-15 cDNA，进行了原核及真核表达；构建了转染hIL-15 cDNA的小鼠肺腺癌细胞系LA795A和人肺鳞癌细胞系PG1，并进行了体内致瘤性研究。研究结果显示，LA795A细胞在小鼠体内的致瘤性明显降低，有明显的抑制肿瘤生长作用；PG1细胞在裸鼠体内能够产生抗肿瘤肺转移作用，其抗瘤作用的产生至少为NK和T细胞依赖的。研究还发现IL-15基因修饰瘤苗通过分泌IL-15诱导淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α，提高机体的CTL活性和NK杀伤活性来增强对肿瘤的抑制作用。此外，IL-15基因转染肿瘤细胞后，细胞表面MHC I类分子表达显著降低，对NK细胞的杀伤敏感性大大增强。随后进行的基因治疗研究发现，IL-15裸质粒DNA对T739荷瘤小鼠有明显的早期局部治疗作用，可提高小鼠的存活率，延长存活期，并对防止肿瘤发生有一定的保护作用。此外，研究还发现，IL-15裸质粒DNA治疗后，小鼠脾细胞I类及II类MHC分子表达和CTL/NK细胞毒活性均升高，进一步佐证IL-15是通过促进机体APC细胞的呈递作用增强CD₈⁺T细胞的CTL活性，而且，NK细胞毒的杀瘤作用举足轻重，也是提高肿瘤杀伤能力的关键因素。

以阳性克隆建立原始种子库，该种子库的检测表明无外源因子污染，各项生化指标达到要求，表达水平达到要求。本发明提供了一种重组人IL-15的新型发酵方法，采用大肠杆菌表达体系以包涵体表达，通过优化发酵工艺，整个过程稳定、快速、简便，获得高密度、高表达水平的重组人IL-15。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高密度的重组人IL-15的表达方案。包括用于该方案的培养基及诱导条件。

在本发明的第一方面，提供了一种重组人IL-15的中试生产方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，在摇瓶中培养如权利要求4所述的表达载体，从而以包涵体形式表达出重组人IL-15；

b)在适合的表达条件下，在5L发酵罐中优化出最佳中试生产方案。

在本发明的二方面，提供了一种工程菌，其特征在于，它含有编码人IL-15的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的工程菌是大肠杆菌。

附图说明

无。

具体实施方式

本发明人根据人IL-15的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则，人工合成重组人白细胞介素-15基因的全序列，将它克隆入质粒pET-30a(+)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，经表达筛选获得IL-15高表达工程菌。

发明人通过深入、广泛的研究，通过对重组人IL-15的一系统列优化表达实验，为上罐发酵确定了基本工艺条件；然后该工艺又通过在发酵罐水平(5L)进行了不断地优化与验证，最终确定了本工程菌稳定的发酵工艺，通过表达稳定性研究，获得了能在大肠杆菌表达体系中稳定高效表达的重组人IL-15。在此基础上完成了本发明。