[发明专利]N-糖基化基因工程改造毕赤酵母

权利要求书

1.一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，它包括步骤：

a.设计OCH1引物，用PCR方法，获得毕赤酵母的OCH1基因序列，在OCH1序列ORF靠近5’端引入2个终止子，重组到pPICZB质粒中，该质粒转染到GS115细胞内，获得OCH1基因失活的重组子。

b.用PCR方法，获得T.reesei 1，2-mannosidase的基因序列和酵母HDEL基因序列，并将此二序列按开放阅读框保持不变的方式拼接后，重组到pGAPZαA质粒内，将此质粒转染到上述重组子，获得二级重组子M5。

c.用PCR方法，从人细胞中获得GnTI序列，从酿酒酵母中获得α-mannosyltransferase Kre2p序列，将Kre2p的N-端穿膜序列与GnTI催化区域序列拼接后装入到pPIC9中，再转染毕赤酵母细胞株。

2.如权利要求1所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的OCH1基因为SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

3.如权利要求1所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的T.reesei 1，2-mannosidase基因为SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

4.如权利要求1所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的HDEL基因为SEQ ID NO：3所示的DNA序列。

5.如权利要求1所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的GnTI基因为SEQ ID NO：4所示的DNA序列。

6.如权利要求1所述的对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的α-mannosyltransferase Kre2p基因为SEQ ID NO：5所示的DNA序列。