[发明专利]N-糖基化基因工程改造毕赤酵母

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，包括有关的工程菌的构建。

背景技术

毕赤酵母表达系统引起了广泛重视，并逐渐应用于药用蛋白质的生产。但是，影响毕赤酵母表达系统在药用蛋白质领域的进一步广泛应用的主要限制因素是毕赤酵母表达的糖蛋白质的糖苷链的结构与哺乳动物的不同，不能用于人体。

迄今为止，所有用于人体的基因重组糖蛋白都是用哺乳动物细胞或昆虫细胞表达的。由于这两个系统本身的原因，使得重组糖蛋白药物的产量受限，价格昂贵。如果毕赤酵母表达的糖蛋白具有人的糖苷链结构，将会有很大的经济和社会意义。

毕赤酵母的N—糖基化通路在起始阶段与哺乳动物的相同，在oligosaccharyltransferase作用下使(Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2在内质网中转移到新合成的蛋白上，接着在glucosidase I和II以及α-1，2-mannosidase作用下，成为带有Man8GlcNAc2的糖蛋白，此时糖蛋白从内质网进入到早期高尔基体。在哺乳动物中，Man8GlcNAc2糖苷降解成Man5GlcNAc2，然后在β-N-acetylglucosaminyltransferase I(GnTI)酶的作用下加上GlcNAc，在mannosidase II作用下除去2个甘露糖残基，在GlcNAc transferase作用下加上GlcNAc，在galactosyltransferase作用下加上半乳糖，在sialyltransferase作用下唾液酸化。在酵母中，Man8GlcNAc2在α-1，6-mannosyltransferase(Ochlp)的作用下添加甘露糖。α-1，6-mannose在mannosyltransferase和phosphomanosyltransferase作用下，继续延长，形成高甘露糖糖苷结构。

国外研究人员对毕赤酵母蛋白糖基化修饰途径和人源化改造情况进行了研究。认为首先要去除酵母内源性糖基化反应的机制，然后在酵母的内质网和高尔基体中导入人的糖基化反应因子，可达到酵母人源化糖基改造的目的。

Choi等用同源重组的方法，将毕赤酵母的α1，6-甘露糖转移酶(Ochlp)活性的消除。将霉菌来源的α-1，2-mannosidase C末端加上ER定位序列HDEL转入到该细胞株。接着构建了三个文库：第一个由定位于酵母内质网和高尔基体的膜蛋白的N—端穿膜序列DNA的前导文库；第二个为含人、鼠、霉菌、线虫、果蝇α-1，2-mannosidase催化区域DNA的文库；第三个为含人、蛙、线虫GnTI催化区域DNA的文库。第一个前导文库如果与第二个或第三个联合应用时前导结构即与催化区域结合产生一个编码嵌合蛋白的基因。作者以人纤溶酶原K3片段为报告基因，用这三个文库转染上述基因改造过的细胞，进行联合筛选，得到酿酒酵母MNN9前导序列与人GnTI催化区域组成的嵌合蛋白可以在酵母内合成人源化糖苷链。

以上研究表明，通过对酵母N-糖基化路径进行基因工程改造，即可产生出人源化寡糖修饰的重组蛋白。同时，对毕赤酵母用基因工程的方法进行改造不影响细胞的存活。该技术可以广泛应用到药用蛋白质的生产及蛋白质功能的研究领域。

发明内容

本发明的目的就是提供一种对酵母N-糖基化路径进行基因工程改造的方法。

本发明的另一目的就是提供经过糖基化基因工程改造，用于糖基化蛋白表达的表达载体及工程菌株。

在本发明的第一方面，就是提供了一种对毕赤酵母的糖基化旁路进行基因工程改造的方法，其特征在于，其改构后的细胞株表达的糖基链更短，和人的糖基之间的同源性更高，且不会影响宿主菌的生存活性。

在本发明的第二方面，就是提供了一种通过权利要求书2所述方案获得的酵母细胞株，其可以表达含有完整人源化糖苷链的糖蛋白。

附图说明

图1：M5/pPIC9/HCGβ-oLHα的诱导后SDS-PAGE鉴定结果。1-3:1号克隆依次48，72，96hr的电泳；4-6：2号克隆依次48，72，96hr的电泳；7-9：4号克隆依次48，72，96hr的电泳