[发明专利]一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法

权利要求书

1.一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：各阶段培养基组分和各组分在每升培养基内所含重量为：

A)基本培养基：其中，诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L，琼脂7g/L的MS为基本培养基；生根培养基以蔗糖30g/L，琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基；试管球茎膨大培养基以蔗糖40～50g/L，琼脂6g/L的MS为基本培养基；种质保存培养基以蔗糖20g/L，琼脂8g/L的1/2MS为基本培养基；pH均为5.6～5.8；

B)诱导培养基M1：MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青霉素50mg/L；

C)增殖培养基M2：MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青霉素100mg/L；

D)生根培养基M3：1/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L；

E)球茎膨大培养基M4：MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac 1 g/L；

F)种质保存培养基M5：1/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青霉素100mg/L；

(2)外植体消毒、接种及诱导培养：选取彩色马蹄莲健康、饱满母球，用自来水刷洗泥土及最外层褐色表皮，冲洗约20分钟后，切取母球上1cm3的块茎芽眼，经自来水冲洗后，于超净操作台上用75％酒精浸泡0.5分钟，无菌水冲洗3次，0.1％HgCl₂水溶液常规灭菌12min，无菌水冲洗3～5次，剥取0.5mm以下茎尖分生组织，接种于诱导培养基M1中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；或选取彩色马蹄莲组培生产过程中无内生菌污染且生长健康的植株，剥取0.5mm以下茎尖分生组织为诱导、增殖对象；

(3)增殖培养：将步骤(2)已成活且无污染的丛生芽转接到增殖培养基M2中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；继代周期为一个月，将块状芽丛剪成小块进行扩繁；

(4)生根培养：挑选步骤(3)中健壮丛状小植株剪成单株转接到生根培养基M3中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月，长成4-6条白色长根的小苗；

(5)球茎膨大培养：挑选步骤(4)根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大培养基M4中进行试管养球，在22-25℃，光照12-16h/d，光强2000-3000Lx下培养约一个月时间；

(6)种质保存培养：挑选步骤(5)小子球饱满的植株转接到种质保存培养基M5中，在10-15℃，光照10h/d，光强1000Lx环境下保存，保存期长达15个月以上；

(7)恢复培养：将步骤(6)保存培养一年以上已进入半休眠状态的小子球植株，先转移到同步骤(2)培养条件下恢复培养一个月，再转接到新鲜的诱导培养基M1中进行二代或二代以上的组培繁殖；

(8)遗传稳定性检测与利用：观察并挑选步骤(7)组培繁殖的小子球生长、增殖状况正常，长势旺盛，增殖率为3.8-4.2，经可溶性蛋白和过氧化物酶(POD)检测未发生遗传变异的植株；该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存；或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog(MS)培养基。