[发明专利]一种生产长春花生物碱的方法

权利要求书

1.一种生产长春花生物碱的方法，包括下述步骤：

1)将长春花的外殖体进行脱分化培养得到长春花愈伤组织并经过继代培养获得疏松快速生长的细胞系；

2)将步骤1)所获得的长春花愈伤组织细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中诱导培养得到多倍体细胞系，然后进行扩增培养获得大量长春花多倍体细胞；

3)将步骤2)得到的长春花多倍体细胞接种于合成培养基中培养得到富含长春花次生代谢产物的细胞；

所述合成培养基为基本培养基中添加1.0-5mg/L萘乙酸、30-60g/L蔗糖、10-50mg/L色氨酸、50-200mg/L谷氨酰胺、1-3mg/L辅酶A、2.1-8.4mg/L萘普生、0.15-0.30mg/L阿司匹林、1-5mg/L布诺芬得到的培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述脱分化培养用培养基为在基本培养基的基础上添加吲哚乙酸1.0-5.0mg/L，细胞分裂素1.0-5.0mg/L，20-40g/L蔗糖的培养基；所述步骤2)中，所述秋水仙碱的浓度为10-40mg/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述继代培养用培养基为基本培养基中添加20-60g/L蔗糖，1.0-5mg/L植物细胞生长素和1.0-5mg/L植物细胞分裂素的培养基；所述继代培养为继代3代以上。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述长春花的外植体为长春花的幼茎、节间或叶片；所述脱分化培养为在18-25℃，光照强度为1000-3000Lux，每日10-16小时照光条件下进行培养3-4周；所述扩增培养用培养基为基本培养基的基础上添加了1.0-5mg/L的NAA，1.0-5mg/L的6-BA，质量百分含量为2-6％的蔗糖而得到的培养基。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述基本培养基为MS培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还包括在扩增培养前将所述多倍体细胞进行继代驯化培养3代以上。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述诱导培养是在20-30℃，避光，80-120rpm/分转速的摇床上振荡培养3-7天；所述扩增培养是在20-25℃，避光条件下培养3-4周；所述步骤3)中，所述长春花多倍体细胞是在25-30℃，黑暗条件下，80-120rpm的摇床或大型生物反应器培养3-7天得到富含长春花生物碱的细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述继代培养的条件为20-25℃，避光条件下培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将所述富含长春花生物碱的细胞用溶剂萃取获得长春花生物碱；所述溶剂为甲醇和/或乙酸乙酯。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述长春花生物碱为长春质碱。