[发明专利]一种生产长春花生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产长春花生物碱的方法。

背景技术

长春花(periwinkle)拉丁名为(Catharanthus roseus(L)G.Don)是夹竹桃科中生物碱含量较为丰富的一属。长春花生物碱主要有：Aspicospermatan型如文多灵(Vindoline)等、Ibogan型如长春质碱(Catharanthine)等、Corynanthean型如阿玛碱(Ajmalicine)和蛇根碱(Serpentine)等和Bisindoles型如长春碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)等。

五十年代中期，一些学者在研究长春花植物降血糖作用时分别发现长春花植物的提取物还具有降低白血球的作用。1958年，加拿大Noble和Beer等共同分离了这一活性成分，命名为Vinblastine(长春花碱)，并制备了其硫酸盐。

随后美国Lily公司证明了长春花粗生物碱可治疗急性淋巴白血病；长春新碱(Vincristine)具有抗癌作用；并开发了长春花碱和长春新碱，应用于临床。长春花碱在临床上主要用做治疗何杰金氏病以及绒毛膜癌，对乳腺癌效果也较好，长春新碱主要用于治疗儿童急性淋巴白血病和髓白血病，它们同时具有光谱抗癌活性。药理学家证明长春碱和长春新碱的抗癌机理是其与微管蛋白结合，阻滞微管蛋白聚合形成微管和诱导微管解聚，因而使细胞停止在细胞分裂中期而死亡。

目前，长春花碱和长春新碱仍主要从长春花植物中提取，长春花是这些生物碱的唯一来源植物。由于这两种生物碱在植物体内含量很低，分别为十万分之几和百万分之几，且无法用化学合成的方法生产，长春花碱和长春新碱的产量远远不能满足市场的需求，导致市场价格据高不下，实际应用受到很大限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产长春花生物碱的方法。

本发明所提供的生产长春花生物碱的方法，包括下述步骤：

1)将长春花的外殖体进行脱分化培养得到长春花愈伤组织，经过继代培养获得疏松快速生长的细胞系；

2)将步骤1)所获得的长春花愈伤组织细胞系在添加秋水仙碱的基本培养基中诱导培养得到多倍体细胞系，然后进行扩增培养获得大量长春花多倍体细胞；

3)将步骤2)得到的长春花多倍体细胞接种于合成培养基中培养得到富含长春花次生代谢产物的细胞；

所述合成培养基为在基本培养基的基础上中添加1.0-5.0mg/L萘乙酸、30-60g/L蔗糖、10-50mg/L色氨酸、50-200mg/L谷氨酰胺、1.0-3.0mg/L辅酶A、2.1-8.4mg/L萘普生、0.15-0.30mg/L阿司匹林、1.0-5.0mg/L布诺芬得到的培养基。

所述方法中，所述脱分化培养用培养基为基本培养基中添加吲哚乙酸1.0-5.0mg/L，细胞分裂素1.0-5.0mg/L，20-40g/L蔗糖，5.0-7.0g/L琼脂，pH调整为5.5-6.0得到的培养基。

所述方法中，所述长春花外植体为长春花的幼茎、节间或叶片；所述脱分化培养是在18-25℃，光照强度为1000-3000Lux，每日10-16小时照光条件下进行培养3-4周。

所述方法中，所述步骤1)中，所述继代培养用培养基为在基本培养基的基础上添加20-60g/L蔗糖，1.0-5.0mg/L植物细胞生长素NAA和1.0-5.0mg/L植物细胞分裂素6-BA的培养基。

所述方法中，所述继代培养的条件均可为20-25℃，避光条件下培养。

所述方法中，所述步骤2)中，所述秋水仙碱的浓度为10-40mg/L；所述诱导培养是在20-30℃，黑暗条件下，80-120rpm的摇床培养3-7天获得的多倍体细胞群。

所述方法中，所述步骤2)中，还包括在扩增培养前将所述多倍体细胞进行继代驯化培养3代以上。

所述步骤2)中，所述扩增培养基为基本培养基的基础上添加了1.0-5.0mg/L的NAA，1.0-5.0mg/L的6-BA，质量百分含量为2-6％的蔗糖的培养基。

所述方法中，所述基本培养基均为MS培养基。

所述扩增培养是在20-25℃，避光条件下培养3-4周；

所述步骤3)中，所述长春花多倍体细胞的接种质量百分含量为10-30％；

所述步骤3)中，所述合成培养是在20-25℃，避光，80-120rpm/分转速的摇床上振荡培养3-7天；

所述方法中，还包括将所述富含长春花生物碱的细胞用溶剂萃取获得长春花生物碱；所述溶剂为甲醇和/或乙酸乙酯。