[发明专利]格尔德霉素的新衍生物Gdm－CT－1－1及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及利用基因工程技术改造制备抗生素的新衍生物，具体而言，涉及利用基因工程技术获得格尔德霉素的新衍生物CT-1-1及其制备方法。

技术背景：

吸水链霉菌17997(Streptomyces hygrocopicus 17997)是中国医学科学院医药生物技术研究所从我国土壤中分离到的，经鉴定其可以产生格尔德霉素(geldanamycin，Gdm)。Gdm具有抗原虫、抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种生物学活性[Sasaki K et al.J Antibiot(Tokyo)1979，32(8)：849-51]；[陶佩珍等，中国抗生素杂志，1997，22：368-372]。根据最近报道，Gdm还具有调节上皮氮氧合酶活性以及抗炎等作用[Murphy P et al Journal of Neuroscience Research，2002，67(4)：461-470]。经研究证实，格尔德霉素的特异性作用靶点是热休克蛋白90(heat shockprotein 90，Hsp90)。Hsp90是许多信号蛋白的伴侣分子，Gdm通过对Hsp90的抑制，可以间接影响细胞内信号蛋白的功能，因此，有望成为一种颇具潜力的抗肿瘤和抗病毒药物。但是Gdm还存在毒性大及水溶性差等缺点，水溶性差会影响其生物利用度，这些缺陷将限制其开发成为有效药物。所以，寻找一种毒性低、水溶性好的衍生物，已成为其深入研究的主要目标。目前，已有两个在C17位进行取代的Gdm衍生物17-AAG和17-DMAG，相继在美国进行II期和I期临床试验[Goetz MP et al J Clin Oncol，2005，23(6)：1078-1087]；[Glaze ER et al.，CancerChemother Pharmacol.2005，56(6)：637-647]。

Gdm的生物合成，是以3-氨基-5-羟基苯甲酸为起始物，2C单位为延伸单位，包括1个丙二酰，4个甲基丙二酰和2个甲氧基丙二酰，在荷载域和7个聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)模块，顺序进行碳链的延伸反应形成聚酮链骨架，再经过酰胺合酶的环化，形成格尔德霉素前体原Gdm。然后通过后修饰过程，包括：C17位的羟基化及氧甲基化、C21位的氧化、C7位的氨甲酰基化和C4，5位的氧化，最终形成Gdm。为了实现对Gdm生物学方法的改造，本实验室从Streptomyces hygroscopicus 17997基因文库中克隆了与Gdm生物合成相关的基因簇[高群杰等，中国抗生素杂志，2002，27(1)：13-27]；[赫卫清，王以光，中国生物工程学报，2006，22：902-906]。通过阻断吸水链霉菌17997中的格尔德霉素生物合成基因-氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的方法，获得一种新的格尔德霉素衍生物4，5-双氢-7-氧-脱氨甲酰基-7-羟基-19-甘氨酰格尔德霉素(4，5-dihydro-7-O-descarbamoyl-7-hydroxy-19-glycylgeldanamycin)，命名为Gdm-CT-1-1。Gdm-CT-1-1水溶性比Gdm增加了500多倍。本发明所述通过基因工程技术在C19位进行修饰获得Gdm新衍生物Gdm-CT-1-1及其制备方法，为制备水溶性好的Gdm衍生物提供了新的途径。

利用生物学方法在Gdm C19位进行修饰获得新衍生物的研究，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供了格尔德霉素的新衍生物Gdm-CT-1-1，其结构如式(1)所示：

本发明还提供了新衍生物Gdm-CT-1-1的制备方法，具体步骤包括：

1、Gdm生物合成阻断变株的构建

采用具有氨苄青霉素抗性(Amp^R)和硫链丝菌素抗性(Tsr^R)的大肠杆菌和链霉菌的穿梭载体pGH112构建基因阻断载体，以吸水链霉菌17997基因组为模板进行PCR，分别获得与gdmN基因同源的两个片段，在其中间以相应的酶切位点插入阿普拉霉素(apramycin，Am)抗性基因，并与pGH112载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，获得用于目的基因阻断的重组载体；