[发明专利]一种全层生物角膜及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种全层生物角膜的制备方法，所述生物角膜以动物角膜脱细胞基质为 载体，在所述脱细胞基质上还有体外培养和扩增的动物角膜基质细胞、上皮细 胞及内皮细胞，其特征在于所述生物角膜通过以下技术方案实现：

(1)作为载体的脱细胞基质的制备：取新鲜动物角膜，机械法去除上皮层、 撕除后弹力层后，浸于含1％TritonX-100，4℃振荡72小时脱细胞，再用PBS 缓冲液反复振洗，组织采取切除前板层和后板层，保留中间三分之一厚基质层， 静置-80℃冻存过夜后，转入真空干燥处理24小时，所述脱细胞基质应用前分别 在PBS缓冲液和无血清的DMEM培养基中复水，4℃保存备用；

(2)基质、上皮和内皮细胞的培养和扩增：无菌取另一动物角膜，显微镜 下剥离所述角膜上皮层、基质层，沿Descemet膜撕下内皮层，取角膜缘上皮 1mm×1mm组织块，贴壁法培养于含10％胎牛血清且DMEM∶F12＝1∶1的培养 基中；基质层用3％II型胶原酶，消化法制成细胞悬液种植于培养皿；胰酶消化 后弹力层上角膜内皮细胞，种植培养基中；各细胞静置37℃，5％CO₂饱和湿度 培养箱培养，隔日换液，细胞生长大于80％融合时，胰酶消化、离心，制成细 胞悬液，按1∶2或1∶3分配接种于新的培养皿传代培养，待细胞生长接近融 合后重复上述步骤依次传代消化、传代培养；

(3)生物反应器内培养三维角膜基质层：将角膜基质细胞转染绿色荧光蛋 白基因，对细胞进行荧光标记，然后制成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液于离心 管中，将制备的脱细胞基质载体置入，抽真空使载体浸于细胞悬液中，2小时后 取出细胞载体复合物置于24孔板，再次制角膜基质细胞悬液，以1ml OT针筒 注入载体中央部位，为0.1ml/载体，静置培养4小时后转入生物反应器；

(4)角膜内皮和上皮细胞种植于基质及生物反应器内培养：首先将生物反 应器内培养一周的基质层取出置24孔板，内皮面向上，将角膜内皮细胞制细胞 悬液，滴加于内皮面上，静置培养大于4小时后转入反应器内旋转，20转/分， 再次培养一周时取出，上皮面向上于培养皿，将角膜上皮细胞悬液滴加表面， 同样静置培养4小时后转入生物反应器培养，继续培养一周后终止。