[发明专利]一种全层生物角膜及其构建方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物工程中的医用材料领域，尤其涉及以异种角膜脱细胞 基质为载体在生物反应器中培养构建而成的全层生物角膜，这种生物角膜可用于 生理、药理和病理学基础研究，又可作为供体应用于角膜移植和屈光手术。

背景技术

角膜疾病是一种发病率高、治疗困难的顽固性致盲眼病，各种原因所致的角 膜损伤、溃疡、瘢痕及水肿混浊是当今世界致盲的主要原因之一。目前治疗角膜 混浊的主要方法是板层或穿透性角膜移植，但受到了角膜供体来源缺乏、角膜供 体老龄化、术后并发症以及术后免疫排斥反应等现状的限制。高分子PMMA等材 料的临床应用推动了人工角膜的发展，使其成为继供体来源角膜移植后另一种治 疗途径，但异质性材料与生物组织之间的相容性问题尚未完全解决，由此引起排 异、渗漏感染等严重的并发症，其设计和植入方式还不够成熟。

利用新兴的生物工程和组织工程技术为体外构建出全层生物角膜以替代供体 角膜移植提供了新的思路和和方法。然而生物角膜的构建由于缺乏合适的载体和 近似生理的培养条件，使其研究停留在初步阶段，虽然体外构建人工角膜模型已 初具正常组织结构和功能，但还不能用于移植。最早20世纪90年代Minami等以 胶原混合角膜基质细胞构建出基质层后再种角膜上皮和内皮细胞，得到初具角膜 三层细胞结构的雏形，近年来Griffith等用戊二醛交联的胶原作为人工角膜的支 架，角膜成纤维细胞混合在胶原中培养，将上皮细胞培养在支架表层，内皮细胞 培养在胶原支架的底层，从而构建出与人角膜形态、结构和组织特性功能相似的 角膜等效物。而中国专利CN 1579342A也公开了“一种无细胞异种角膜基质及制 备方法和用途”，其提供了一种可用于人工角膜构建的无细胞异种角膜基质。

已有研究用于生物角膜构建的载体材料包括天然的细胞外基质、天然和合成 高分子材料的复合物、有机材料同无机材料的复合物。常见的有胶原，聚乳酸、 甲壳素、壳聚糖、纳米材料等，但尚未仿生制备出与角膜相近似的纤维板层结构。 角膜构建常用的这些载体也因透明性、机械强度、降解速度等参数并非最佳，构 建出的角膜都不够理想。

要构建出全层生物角膜，其核心是建立角膜细胞与生物材料的三维空间复合 体，载体支架是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响构成的 组织形态与功能。角膜特有的结构是维持角膜透明、屈光、通透性等正常生理功 能的重要因素，通过生物化学方法将细胞成分去除而保留正常组织的细胞外基质 成份及结构的脱细胞组织基质作为支架，具有良好的生物学特性，而且来源广泛。 脱细胞角膜基质可保留正常角膜板层排列结构，并具有良好的韧性和适合细胞生 长的生理微环境，同时猪的角膜基质虽为异种的天然同质材料，但具有良好的生 物相容性，尤其是脱细胞处理后抗原性极低，是构建生物角膜的良好载体。

传统的角膜构建方法都是在培养皿中静态培养，不利于组织和细胞进行营养 交换和新陈代谢，而近年来生物反应器在体外细胞培养和组织重建研究领域中发 挥越来越重要的作用，通过模拟体内动态环境，为细胞生长提供不断新鲜的营养 物质并带走代谢产物，从而改善离体细胞的培养条件；同时细胞及组织在动态中 更有利于细胞外基质的分泌和细胞间的信号转导；细胞在生物反应器中有一定程 度的三维空间自由，有利于细胞-细胞、细胞-基质之间按组织学特性相互接触，且 不易形成坏死中心。生物反应器的上述特点使之成为组织工程化器官和组织体外 重建的理想装置。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的可用于移植的全层生物角膜，该全层生物角膜 以动物角膜脱细胞基质为载体，在所述脱细胞基质上还有体外培养和扩增的动物 角膜基质细胞、上皮细胞及内皮细胞。

本发明的另一个目的是提供这种全层生物角膜的构建方法，该方法通过以 下技术方案实现：

(1)作为载体的脱细胞基质的制备：取新鲜动物角膜，机械法去除上皮层、 撕除后弹力层后，浸于含1％TritonX-100，4℃振荡72小时脱细胞，再用PBS 缓冲液反复振洗，组织采取切除前板层和后板层，保留中间三分之一厚基质层， 静置-80℃冻存过夜后，转入真空干燥处理24小时，所述脱细胞基质应用前分别 在PBS缓冲液和无血清的DMEM培养基中复水，4℃保存备用；