[发明专利]利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

权利要求书

1.一种利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)购回的市售药用灵芝菌株，保藏和培养；

(2)将培养好的药用灵芝菌丝体经洗涤沉淀，研磨成粉末状；

(3)药用灵芝DNA的提取和纯化；

(4)药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测；

(5)从药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，通过进一步的序列测定和酶切电泳，发现差异，利用差异进行鉴别；

(6)从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，通过电泳检测，发现差异，利用差异进行鉴别，判定检测结果。

2.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(3)中所述的药用灵芝DNA的提取和纯化，采用高盐低pH提取法提取基因组DNA，包括以下步骤：

①经液氮研磨的样品放入65℃预热的提取缓冲液，放入65℃水浴保温30min，不时缓慢振摇，室温下10,000×g离心10min；

②在上清液中加入2/3体积的KAc高盐溶液，混匀后置于0℃保持30min以沉淀蛋白质；

③在4℃下10,000×g离心10min，弃蛋白质沉淀，上清液加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，在6,000×g离心10min，取出水相转入另一离心管，

如果中间层仍有白色沉淀，则再用氯仿/异戊醇抽提一次；

④在上清液中加入2/3体积的预冷异丙醇，混匀后置于-20℃静置30min，以沉淀核酸，可以重复一次，用70％乙醇清洗沉淀，在空气中干燥50min，将DNA沉淀溶解在合适体积的TE缓冲液中，分装存放于-20℃或4℃冰箱中保存。

3.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(5)中所述的从所选药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，设计了两对引物序列：

第1对：FIP A：5’-ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3’和FIP B：5’-CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3’；

第2对：FIPGF：5’-CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3’和FIPGR：5’-CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3’。

4.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(5)中所述的从所选的药用灵芝菌丝中均能扩增出的336bp和721bp的特异性条带，是指：以提取的药用灵芝菌丝DNA为模板，使用引物FIP A和FIP B，进行标准程序的PCR扩增，从药用灵芝来源的赤灵芝、紫芝和松杉灵芝菌丝中均能扩增出336bp大小的特异性条带；使用引物FIPGF和FIPGR，进行标准程序的PCR扩增，从赤灵芝、紫芝和松杉灵芝中也均能扩增出721bp大小的特异性条带。

5.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(6)中所述的从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，设计了三对引物序列：

第1对：FIPGLUF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’和FIPGLUR：5’-CGCTATGCCATACCCGGAGTTG-3’；

第2对：FIPGSIF：5’-GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3’和FIPGSIR：5’-ACCCCAACAGGTTCGTCGACAACG-3’；

第3对：FIPGTSF：5’-TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC-3’和FIPGTSR：5’-AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA-3’。

6.根据权利要求1所述的利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，其特征是，步骤(6)中所述的从药用灵芝菌丝中分别扩增出580bp、495bp和836bp的特异性条带，是指：以提取的药用灵芝菌丝DNA为模板，使用引物FIPGLUF和FIPGLUR只能从赤灵芝中扩增得到580bp大小的特异性条带；使用引物FIPGSIF和FIPGSIR只能从紫芝中扩增出495bp大小的特异性条带；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR只能从松杉灵芝中扩增出836bp大小的特异性条带。