[发明专利]利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物工程技术领域的检测方法，具体地涉及一种利用特异基因序列鉴别对药用灵芝的检测方法。

背景技术

对于药用灵芝的检测，传统的鉴定方法主要是依靠形态学鉴定，主要是灵芝子实体的形、色、气、味、质地等外观性状观察，该方法简便、直接，缺点是主观性强，其准确性完全取决于检验者的经验判断，且难以鉴定加工炮制后的碎片或粉末药材。目前较多的是从生物分类学(基原鉴定)、组织学(显微鉴定)、化学(理化鉴定)角度建立了相对比较客观的检测标准；同时，随着科学技术的发展，细胞学、酶学(同工酶分析)、生物化学(蛋白质分析及效价评价)、血清学(免疫测定)等生物技术亦逐渐应用到灵芝鉴定中来。分子生物学研究发现，中药(不含矿物类)所依赖的生物资源一“物种”的多样性是由于其基因(核苷酸序列)多态性的结果，而基因(核苷酸序列)多态性可在分子水平上检测，它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表中药的遗传变异。

以个体间遗传物质内核苷酸序列的变异为基础进行个体的鉴别方法称为分子标记(Molecular Genetic Markers)或分子诊断技术(DNA-Based DiagnosticTechniques)，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种标记-形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有明显的优越性：分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。利用特异基因序列进行鉴别是分子标记的一种新的类型，他是基于PCR和(或)限制性酶切技术的DNA标记，他能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性。基于PCR技术的基本原理是利用鉴别物种已知的DNA序列，通过比对，找出每一个物种特有的DNA序列，设计出一套特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这一引物扩增出该物种的一段特异的DNA序列，凝胶电泳，染色并对条带进行分析。此方法揭示的是特异片段的有和无的信息。基于PCR和限制性酶切技术的DNA标记是利用鉴别物种的特征序列(如与此物种功能相关的基因)，设计出一对特异性的PCR引物(19-27bp)，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一或两种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并对条带进行分析。此方法揭示的是特异片段的限制性长度变异的信息。

经对现有技术文献的检索发现，苏春丽、唐传红、张劲松、潘迎捷，文章名称：基于β-微管蛋白基因部分序列探讨灵芝属菌株的亲缘关系(菌物学报，2006，25(3)：439~445)，研究者利用β-微管蛋白基因部分序列对灵芝属菌株的亲缘关系进行了探讨，利用特征序列进行物种的鉴别是一种较新的分子标记技术，在药用灵芝的鉴别研究中，利用此特异序列可对树舌亚属、紫芝组和灵芝组之间的菌株进行鉴别。但上述文章涉及的技术不能区分灵芝组内的菌株。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用特异基因序列鉴别药用灵芝的检测方法，本发明利用PCR扩增、序列测定和(或)限制性内切酶酶切技术对药用或食用灵芝菌株、原药材，精粉，切片、孢子粉以及破壁孢子粉特异基因序列(真菌免疫调节蛋白基因的编码区和非编码区序列)进行鉴定，以获得药用灵芝特异的序列特征和电泳检测图谱。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明具体包括如下步骤：

(1)购回的市售药用灵芝菌株，保藏和培养；

放在4℃冰箱保藏，每3～5个月更换一次培养基。将斜面菌株放至28℃活化24h，挑取斜面试管菌种的菌丝接至PDA固体培养基平板上，28℃恒温培养7d。用接种铲将1cm²左右的平板菌种接至YPS液体培养基，并捣碎。28℃，120rpm震荡培养。

(2)将培养好的药用灵芝菌丝体经洗涤沉淀，研磨成粉末状；

将培养好的菌丝体10,000g离心10min，去上清，加入PBS缓冲液洗涤沉淀三次，用液氮将洗涤好的菌丝体研磨成粉末状。

(3)药用灵芝DNA的提取和纯化；

(4)药用灵芝特异基因序列的序列测定、PCR产物的电泳检测和限制性内切酶酶切产物的电泳检测；

(5)从药用灵芝的菌丝中扩增出的336bp和721bp的特异性条带，通过进一步的序列测定和酶切电泳，发现差异，利用差异进行鉴别；