[发明专利]用于催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种基因工程菌及其构建方法，更具体地说，涉及一种用于生物催化柠檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

香茅醛是一种重要的单离香料，广泛用于饮料、糖果、食品等的加香和其它香精的配制，还是合成其它香料的原料。工业上主要由香茅油、桉树油等精油中分离得到。也可以通过柠檬醛催化加氢或以β-香茅醇加氢制得。

微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛的反应式如下：

其机理是利用微生物代谢中产生的氧化还原酶选择性的催化加氢。反应过程中需要辅酶NADH(还原型辅酶I)的参与，生成NAD⁺(氧化型辅酶I)。利用生物转化法催化柠檬醛加氢生成香茅醛与其他方法相比具有专一性强、反应条件温和、底物利用率高、转化率高、生产工艺简单和副产物少等优点。

虽然国外有关于利用微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛的文献，但国内没有相关的文献和专利报道，而且现有的微生物催化柠檬醛加氢生成香茅醛中所使用的微生物均为野生菌，尚无利用基因工程菌催化柠檬醛加氢生成香茅醛的报道，因此，有必要对此进行研究。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种NADH氧化酶的重组表达质粒，能够转化基因工程菌以表达NADH氧化酶。

本发明的第二个目的在于提供所述重组表达质粒的构建方法。

本发明的第三个目的在于提供一种基因工程菌，能够表达NADH氧化酶。

本发明的第四个目的在于提供所述基因工程菌的构建方法。

本发明的第五个目的在于提供一种生物催化柠檬醛生成香茅醛的方法。

本发明的重组表达质粒是在合适的表达载体上克隆有NADH氧化酶基因gye。

根据本发明，所述NADH氧化酶基因gye可以来源于以下菌中的任一种：大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、醋杆菌(Acetobacter)、克雷伯氏菌(Gluconobacter)；优选的，所述NADH氧化酶基因gye来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。

根据本发明，所述NADH氧化酶基因gye具有SEQ ID NO.1所示的序列。

根据本发明，所述表达载体为pET系列表达载体，优选的，所述表达载体为采用pET28。

本发明的重组表达质粒的构建方法包括以下步骤：

A、扩增编码NADH氧化酶的基因gye的序列；

B、将扩增获得的NADH氧化酶基因gye序列经酶切后，连入经相同酶切的pET系列表达载体中，获得NADH氧化酶的重组表达载体。

本发明的基因工程菌株转化有上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重组表达质粒。

本发明的基因工程菌株的构建方法包括将上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重组表达质粒转入宿主菌，获得表达NADH氧化酶的基因工程菌。

根据本发明，所述基因工程菌为大肠杆菌，优选的，所述基因工程菌为大肠杆菌BL21。

本发明的生物催化柠檬醛生成香茅醛的方法，包括以下步骤：

A、发酵所述基因工程菌以表达NADH氧化酶；

B、向发酵液中加入底物柠檬醛，通过NADH氧化酶催化加氢获得香茅醛。

将获得的基因工程菌进行发酵，向发酵液中加入底物柠檬醛，溶液，获得香茅醛。

本发明开辟了利用基因工程菌生产香茅醛的先例，使得普通大肠杆菌具备了催化柠檬醛生成香茅醛的功能，这为今后构建生产香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。

附图说明

图1为基因工程菌BL21/gye的发酵表达产物经纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为经过His-Tag柱纯化后的GYE蛋白；泳道2为表达后没有纯化的破壁上清液；泳道3为蛋白标准分子量；泳道4为没有重组的BL21的破壁上清液。

图2显示了基因工程菌BL21/gye表达的NADH氧化酶催化柠檬醛后的产物质谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。