[发明专利]猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ作为猪生产性状的遗传标记及应用

说明书

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及猪异柠檬酸脱氢酶基因IDH3γ基因的克隆及其作为遗传标记在猪生产性状标记辅助选择上的应用。

背景技术

通过生产性状的表型值估算出的育种值进行动物选择性育种，已大大促进了家畜生产性状的遗传改良。九十年代以来，随着分子生物学技术的进步以及在猪领域中的应用，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种相结合，大大加速了猪育种进程。能够应用于分子标记辅助选择的基因或标记必须对目标性状具有较大的遗传贡献率，即主效基因或标记，因此寻找这些主效基因和与之紧密连锁的分子标记成为分子标记辅助选择的前提和基础，也是当前和今后一段时间猪分子生物学领域的研究重点和急需解决的问题。

目前已有多个位于功能基因内部的与生产性状紧密连锁的分子标记被发现并中请专利。例如，在传统的猪育种计划中，由于消费者对瘦肉的兴趣，因此选择主要强调降低脂肪。脂肪降低主要以背膘厚降低来衡量。然而，背膘厚下降同样导致了肌内脂肪的下降，脂肪最后的沉积部位是肌肉，因此肌内脂肪与味道以及肌肉的接受程度呈正相关。为防止肌内脂肪进一步的下降，必须找到影响此性状的分子标记，因当肌内脂肪是很难在活体中度量的。Gerbens等证实了位于猪6号染色体上肌肉组织特异候选基因心脏脂肪酸结合蛋白与猪中肌内脂肪含量和其它生产性状的关系，该基因已被申请专利，其专利号为WO 97/35878；另外，Rothschild等发现了leptin受体基因内与瘦肉率有关的分子标记，其专利号为U.S.Pat.Nos.5972621。

异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)是生物体三羧酸循环(Tricarboxylic Acid Cycle)中的重要的限速酶，负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸，并将氧化型NAD或NADP还原成NADH或NADPH(Chen，Redox electrode for monitoring dehydrogenase-catalyzed reactions.Clin Chim Acta，1990，190(3)：129-37：)。IDH在生物体内有两种存在形式，即以NAD为电子受体的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)和以NADP为电子受体的异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)。NADP-IDH广泛存在于真核生物的各种细胞器(如叶绿体、线粒体等)、胞质和原核细胞中(Camacho等，Isocitrate dehydrogenases fromHaloferax volcanii and Sulfolobus solfataricus：enzyme purification，characterisation and N-terminal sequenceFEMS Microbiol Lett，1995，134：85-90：)。NAD-IDH则普遍被认为仅存在于真核生物线粒体中，但有研究者在嗜酸硫细菌中也发现了NAD-IDH，因此它的分布也似乎变得广泛起来(Inoue等，Biochemical andmolecular characterization of the NAD(+)-dependent isocitrate dehydrogenase from the chemolithotrophAcidithiobacillus thiooxidans.FEMS Microbiol Lett，2002，214：127-132：)。在哺乳动物中，主要有三种形式的IDH，即胞液型NADP-IDH(IDH1)、线粒体型NADP-IDH(IDH2)和线粒体型NAD-IDH(IDH3)。猪IDH2是一个单聚体，分子量为43.6kDa，编码413个氨基酸(Haselbeck等，Isolation and sequence of a cDNAencoding porcine mitochondrial NADP-specific isocitrate dehydrogenase.Biochemistry，1992，31：6219-6223：)。该酶需要1mol的NAPDH或NADP⁺和一种二价金属离子来产生酶活(Benderdour等，Cardiac mitochondrialNADP⁺-isocitrate dehydrogenase is inactivated through 4-hydroxynonenal adduct formation：an event thatprecedes hypertrophy development.J Biol Chem，2003，278：45154-45159)，研究表明，在第311位苏氨酸上结合Mn²⁺将产生最高的酶活性(Bailey等，2-[(4-Bromo-2，3-dioxobutyl)thio]and 2-[(3-bromo-2-oxopropyl)thio]adenosine 2′5′-bisphosphate：new nucleotide analogues that act as affinity labels of nicotinamide adeninedinucleotide phosphate specific isocitrate dehydrogenase.Biochemistry，1987，26：6858-6869：)。IDH1和IDH2不仅在三羧酸循环中发挥作用，而且在线粒体中通过NADPH的再生参与阻止氧化损伤(Ceccarelli等，Crystal structure of porcine mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase complexed with Mn²⁺andisocitrate.Insights into the enzyme mechanism.J Biol Chem，2002，277：43454-43462：)。像IDH2一样，IDH1也是一个单聚体，它可以作为三羧酸循环的一部分参与合成脂肪酸(Koh等，Cytosolic NADP⁺-dependentisocitrate dehydrogenase plays a key role in lipid metabolism.J Biol Chem，2004，279：39968-39974：)。