[发明专利]T型非病毒载体及包含其的复合药物

说明书

技术领域

本发明属于基因治疗药物领域。具体地说，本发明涉及非病毒载体融合蛋白TNFαm2-SON2-GRP与限制性表达绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型重组体5×NFBS-SCP-PEIIImut的复合药物。非病毒载体中的TNFαm2是强效低毒的肿瘤坏死因子α(TNFα)衍生物，SON2是一种DNA结合蛋白，GRP是胃泌素释放肽。毒素基因重组体上的5×NFBS是经5次重复克隆的NF-κB的结合位点，SCP是一种肿瘤特异性启动子，PEIIImut是绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型。本非病毒载体可结合并携带上述毒素基因重组体进入GRP受体阳性的细胞，但毒素基因只能在NF-κB⁺SCP⁺GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞内表达，进而强效杀灭此类对化疗与放疗不敏感的肿瘤细胞。本非病毒载体还可独立地杀伤GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞。本发明还涉及此复合药物及单独的非病毒载体在恶性肿瘤治疗中的用途。 

背景技术

已知上千种来自微生物、植物、动物以及化学合成的蛋白质毒素具有抗肿瘤或抗病毒活性。但它们是人体异源的毒素蛋白质，在付之临床应用时存在两个问题：一是由于其细胞杀伤作用不具备肿瘤细胞特异性，可对人体产生严重的毒副作用；二是其作为人体异源蛋白质，具有很强的免疫原性，导入人体血循环不仅可导致抗体的迅速生成而被中和失活，并可引起人体发生严重的过敏反应。 

久来人们试图改造此类蛋白质以应用于临床对疾病的治疗。如绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素。PE由分别行使受体结合、转位和酶催化(杀伤细胞)活性的三个结构域domain Ia(第1-252位氨基酸)-domainII(第253-364位氨基酸)-domainIb(第365-399位氨基酸)domain-III(第400-613位氨基酸)组成。对PE的改造，曾在提高其杀伤作用的细胞靶向性和降低其免疫原性这两方面进行过探索。目前，PE的应用研究普遍采用蛋白质形式。为避免毒素对正常细胞的毒副作用，实现细胞毒作用对肿瘤细胞的靶向性，首先通过删除结构域Ia来取消PE原有的普遍结合于任何细胞表面的能力。研究还发现，PE分子的细胞毒作用可因第609-613位氨基酸的REDLK被替换为KDEL而显著提高。基此，曾有人探索运用基因工程技术，把经KDEL改造并删除了结构域Ia的PE片段作为细胞毒效应结构域，并将之与肿瘤特异性受体的配体(或抗体)融合，经DNA重组与表达改造成为具有肿瘤细胞靶向性的融合蛋白，如TGFα-PE40，以降低PE的毒副作用。该融合蛋白在体外实验、或临床研究的早期阶段可以收到较好的效果；但进一步临床研究表明，该种导向融合蛋白仍可造成严重的肝毒性；而且其中的绿脓杆菌毒素PE40对人体仍具有很强的免疫原性，在应用于人体的初期即产生抗体，致使该蛋白因中和作用而失效。通过点突变以消除抗原表位只能在一定程度上、部分地降低毒素蛋白的免疫原性，其免疫原性仍然 显著存在。同时，所利用的肿瘤细胞特异性受体往往同时存在于肿瘤细胞与正常细胞表面，所以，此类导向融合蛋白在杀伤肿瘤细胞的同时，还杀伤了其表面也有相同受体的正常细胞。因此，上述关于人体外源毒素蛋白的导向改造是不成功的，寻求其改造新途径是必要的。 

已有研究结果表明，双链DNA是低免疫原性的，而且不引起和促进机体发生系统性自身免疫反应[1]。我们首先考虑将人体异源毒素蛋白质改为其编码基因导入血循环，以从根本上避免前者的免疫原性。 

我们认为，实现基因的靶向转移和表达以确保基因治疗的安全性，是基因治疗设计中必须考虑的首要问题。根据基因作用的原理，如将治疗基因特异性地转移到肿瘤细胞内或将其表达限制在肿瘤细胞内，则可有效避免其对正常组织细胞的伤害，同时也可提高毒素基因转移的准确性与效率，达到靶向性杀伤的效果。