[发明专利]一步三重RT－PCR快速检测百合三种病毒的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及快速检测百合三种病毒的方法。

背景技术

百合三种病毒LMoV、LSV和CMV是造成百合经济减产的主要原因，快速检测是否带有所述病毒，以便及时采取对策，挽回经济损失是上上之策。利用生物技术检测病毒的方法包括1)酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。它是将抗原—抗体免疫反应和酶高效催化过程有机结合在固相载体表面完成反应的一项综合技术。2)反转录PCR技术(RT-PCR)和简并引物反转录PCR技术(IC-RT-PCR)。先将mRNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR，然后再利用其它检测方法(如电泳、核酸探针等)对经扩增的病毒核酸进行检测。3)基因芯片技术是将无数预先设计好的寡核苷酸、cDNA、基因组(Genomic)DNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交，通过荧光共聚焦显微镜扫描，利用计算机对每一个探针上的杂交信号作检测、分析，从而反映目的材料中大量基因表达图谱对样品的序列信息进行高效的解读和分析，大规模获取相关生物信息。上述方法中存在如下问题：

1)以血清学方法为基础的检测技术是在实际生产中应用最广泛，操作简便，可用于大量样品的检测，但是相对该方法需要制备抗血清，常出现假阴性的结果，检测灵敏度和准确性有待提高。

2)现有(IC-)RT-PCR大多一次只能检测一种病毒，多重RT-PCR可以检测出三种百合主要病毒，但是，假阴性反应几率很高，更关键的是现有RT-PCR一般不能确定扩增出的条带是否是假阳性。已有的多重RT-PCR，是将cDNA第一链的合成(反转录)与多重PCR二个步骤分开，耗时较长。已有的其他植物病毒种类的一步法RT-PCR均只能一次检测一种病毒，而且大多数需要使用RNA提取试剂盒，或通过SephadexG-50-80微柱。费用高、过程复杂不能检测超低病毒含量样品，容易出现漏检。

3)基因芯片技术为植物病毒的控制提供一条新的捷径，但是，目前检测百合病毒的芯片技术不够成熟，芯片制作成本非常高，尚不适宜实际检测需要。

现有技术中还没有一次能检测上述三种病毒的方法。

发明内容

针对上述的现有技术的缺陷，本发明提供一种检测方法，能一次同时检测出上述三种病毒，步骤少，效率高，结果精准可靠。

一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法，包括cDNA的合成与三重RT-PCR扩增步骤，其特征在于，所述三重RT-PCR扩增体系中含有下列三对引物：

CMV1：5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG，

CMV2：5’-TCAGACTGGGAGCACTCCG；

LSV1：5’-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG，

LSV2：5’-TTTGTGTATCGATGATTTCGG；

LMoV1：5’-GCAAATGAGACACTTAACGCT，

LMoV1：5’-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG..

所述RT-PCR扩增条件为：30个循环，72℃延伸5min，最后于4℃结束。

所述三重RT-PCR扩增体系中加入的是总RNA提取物，eDNA的合成与三重RT-PCR扩增体系是一步完成的。

所述cDNA的合成条件为：42℃下反转录30min，95℃4min，94℃20s，52℃30s，72℃40s，72℃5min，30个循环。

该方法中还包括假阳性检测步骤，所述假阳性检测是将PCR产物回收、纯化、重组质粒、PCR鉴定、再序列比对确定。

RT-PCR技术，由于PCR是对DNA的体外扩增，而植物病毒大部分为RNA，所以先将mRNA反转录为cDNA再以cDNA为模板进行PCR，然后再利用其他检测方法(如电泳、核酸探针等)对经扩增的病毒核酸进行检测。多重RT-PCR是在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，从而同时扩增多个序列的反应过程。本发明针对CMV、LMoV和LSV三种病毒外壳蛋白CP基因保守序列设计了三对引物，利用该方法扩增不同的目的片段。引物序列分别是：

CMV：上游引物5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG

及下游引物5’-TCAGACTGGGAGCACTCCG；

LMoV：上游引物5’-GCAAATGAGACACTTAACGCT

及下游引物5’-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG；