[发明专利]一种氨基酸生物拆分的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工等领域，尤其涉及一种DL-N-乙酰氨基酸酯直接生物催化水解拆分制备L-氨基酸和D-氨基酸的新方法。

背景技术

组成生物体及参与生物代谢的氨基酸主要有二十种，其余的氨基酸都称为非天然氨基酸，包括D-构型的氨基酸、以天然氨基酸为母体在侧链增加或改换不同基团形成的氨基酸和β或γ-氨基酸三种类型。近年来随着越来越多的具有生物活性的多肽的发现，使氨基酸，特别是特殊结构的氨基酸的需求越来越大，其应用、开发已成为一个非常活跃的研究领域。

绝大多数氨基酸具有手性结构，或为D-型或为L-型。但采用化学合成法制得的氨基酸，通常是DL-外消旋体，没有旋光性。如果要获得单一异构体，必须采用合适的拆分技术。目前报道的拆分技术较多，但化学拆分是主流方法，其次为生物拆分。其中生物拆分一般是将获得的外消旋体转变成N-乙酰化产物，或转化为其对应的酯，再利用酶对不同构型氨基酸衍生物所表现出的催化水解反应的专一性，使某一种构型的衍生物转化为游离的氨基酸，而另一构型的衍生物保持不变，再以其性质的差异予以分离。已报道的生物拆分方法不能直接拆分DL-N-乙酰化氨基酸酯。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种DL-N-乙酰化氨基酸酯为底物，用微生物直接拆分的方法得到L-氨基酸，同时采用化学水解获得D-氨基酸，以弥补现有生物拆分技术中存在的不足。

本发明的构思是这样的：以DL-N-乙酰化氨基酸酯为底物，以米曲霉菌Aspergillus Oyzae Lb3085发酵获得包含有酰胺水解酶和酯水解酶的酶制剂为催化剂，用去离子水为溶剂于酶催化反应器中使底物中的L-N-乙酰氨基酸酯水解为L-氨基酸，而底物中D-N-乙酰氨基酸酯只部分水解为D-N-乙酰氨基酸后，再经化学水解获得另一个异构体D-氨基酸。

本发明的技术方案是这样的：

本发明一种氨基酸生物拆分的新方法，用微生物直接拆分、水解DL-N-乙酰化氨基酸酯为对应的L-氨基酸和D-氨基酸的方法，它包括以下步骤：

①以米曲霉菌Aspergillus Oyzae Lb3085为菌种，以葡萄糖0.5-4％、豆浆30-65％、玉米浆0.2-3.5％、硫酸镁0.05-0.3％、磷酸氢二钾0.2％为培养基，在21-38℃、pH 6.5-8.2左右的条件下发酵15-40h，过滤得湿菌体，冰冻保存。

②在烧瓶中依次加入去离子水、湿菌体、0.03-0.10mol/L Mn+2或Co+2或Zn+2溶液和底物及助溶剂，于18-48℃条件下搅拌反应6-15h，控制溶液的pH6.5-8.2。底物与湿菌体的质量比为1∶2～8。

③过滤除掉废菌丝体，调pH至3.0-5.0，乙酸乙酯萃取，水溶液用离子交换树脂处理，洗脱液蒸发浓缩，即可获得对应L-氨基酸，收率38～47％。

④乙酸乙酯萃取液浓缩回收溶剂后，残余物溶于甲醇，与2M的盐酸一起加热，升温至58-86℃，反应2h，得澄清溶液。调pH至3.8-6.2，浓缩回收甲醇，冷却、过滤即得D-氨基酸，收率32～44％。

其中，所述底物为DL-N-乙酰化氨基酸酯的两个异构体的混合物，所述的助溶剂有1，4-二氧六环、二甲亚砜等，加入的量与去离子水的体积比为1∶6～15，所述的湿菌体含水量一般在13～35％。而二价的锰盐、钴盐和锌盐通常为氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、醋酸盐等。

所述DL-N-乙酰化氨基酸酯包括邻、对、间卤代、烷基、硝基、氨基、羟基、酰基、羧基、磺酰基、烷氧基、酰氧基、烷氨基、酰氨基等单取代、二取代、三取代DL-N-乙酰苯丙氨酸甲酯。

所述DL-N-乙酰化氨基酸酯还包括DL-N-乙酰萘丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰噻吩丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰呋喃丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰吡咯丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰噻唑丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰噁唑丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰吡唑丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰组氨酸甲酯、DL-N-乙酰吡啶丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰嘧啶丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰哒嗪丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰吡嗪丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰喹啉丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰异喹啉丙氨酸甲酯、DL-N-乙酰色氨酸甲酯等芳基丙氨酸酯，

所述DL-N-乙酰化氨基酸酯还包括DL-N-乙酰-β-氨基酸、DL-N-乙酰-γ-氨基酸和DL-N-乙酰-δ-氨基酸。

所述DL-N-乙酰化氨基酸酯还包括其他或含有官能团或不含有官能团的DL-N-乙酰脂肪基氨基酸酯。