[发明专利]兔源IgG核酸适配子及其制备方法和应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----系统进化指数富集技术设计和制备一组与兔源IgG高特异性和高亲和力结合的兔源IgG核酸适配子及其应用。

(二)背景技术：

兔源IgG是用于抗原检测的单抗的主要种类，广泛应用于实验室和临床诊断领域。其高特异性、高亲和性的配体，对于兔IgG的分离纯化以及检测具有重要意义，可替代生物医学研究中广泛使用的二抗。

SELEX技术(系统进化指数富集技术)是90年代初研制的一种新的组合化学技术，其利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列一般长度在20～40bp左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间，由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核酸适配子具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比抗体更高的亲和性和特异性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d.稳定性好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子在临床检测及诊断中具有良好的应用前景。

(三)发明内容：

本发明的目的是提供一种兔源IgG核酸适配子，它通过SELEX技术筛选兔IgG的核酸适配子。与现有兔IgG的特异性抗体相比，本发明中的核酸适配子具有更高的特异性、亲和力，因此可替代抗体，用于简洁快速、高灵敏度、高特异性的兔IgG检测及分离纯化方法的建立。

本发明的第二个目的是提供一种兔源IgG核酸适配子替代抗体在兔源IgG检测上的应用或用于兔源IgG的分离纯化。

本发明的第三个目的是提供第二种兔源IgG核酸适配子。

本发明的第四个目的是提供第二种兔源IgG核酸适配子在兔源IgG检测上的应用或用于兔源IgG的分离纯化。

本发明的技术方案概述如下：

一种兔源IgG核酸适配子，其特征在于它是具有序列表中SEQ IDNo.1～SEQ ID No.9的核苷酸序列之一。

上述所述SEQ ID No.1～SEQ ID No.9所述的核苷酸序列具有下述结构之一：

上述所述的核苷酸序列也可以与SEQ ID No.1～SEQ ID No.9中的一种兔源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一同源序列占60％以上，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列也可以与SEQ ID No.1～SEQ ID No.9中的一种兔源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一杂交的寡核苷酸序列，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列也可以用SEQ ID No.1～SEQ ID No.9中的一种兔源IgG核酸适配子的核苷酸序列之一转录的RNA序列。

上述所述的核苷酸序列的不少于一个位置的A或G或C或T或U被稀有碱基甲基化嘌呤或二氢尿嘧啶或次黄嘌呤置换后，使其具有相同功能。

上述所述的核苷酸序列的不少于一个位置进行磷酸化或甲基化或氨基化或巯基化或同位素化或结合生物素或结合地高辛或结合荧光物质或结合纳米发光材料或酶标记修饰，使其具有相同功能。

一种兔源IgG核酸适配子的筛选制备方法，其特征在于，它是由以下步骤构成：

(1)用PCR制备ssDNA文库

文库扩增方案一：

采用对称PCR扩增得到5’端带有生物素的dsDNA文库，后者以链亲和素磁珠为基质进行分离并变性解链，磁分离后经乙醇沉淀得到后续筛选的ssDNA文库。

文库扩增方案二：

采用不对称PCR，获得ssDNA文库。

(2)反筛与筛选

以Protein A-琼脂糖为基质，反筛去掉ssDNA文库中的非特异结合部分，筛选得到与兔源IgG特异结合的ssDNA；

(3)克隆及阳性克隆的序列测定

扩增数轮筛选后所得次级文库，回收目标片段，经连接、转化，挑取单克隆白斑，对PCR反应鉴定的阳性克隆进行序列测定。

一种兔源IgG核酸适配子的应用，其特征在于在实验室、临床及工业化的应用，包括用于兔源IgG的检测、兔源IgG的分离纯化。