[发明专利]组织因子途径抑制剂的微孔板筛选方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种组织因子(TF)途径抑制剂的体外微孔板筛选方法，本发明还公开了利用该方法所筛选出的某些组织因子途径抑制剂。

背景技术

组织因子(tissue factor，TF)，即凝血因子III，又称为促凝血激酶或凝血致活酶(CD142)，为263个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白，属于细胞因子超家族成员。TF既是凝血因子VII在细胞表面的受体，又是FVII或激活的因子VII(F VIIa)的辅因子，是唯一存在于正常人血浆以外的细胞和组织中的凝血因子。现代研究表明，TF和FVIIa复合物是凝血的最重要的启动因子，该复合物启动了凝血级联反应：当血管受损后，血液暴露于能表达TF的细胞表面，随后TF与其配体FVII或FVIIa形成复合物，进而激活凝血因子X和凝血因子IX，同时启动外源性和内源性凝血系统；激活的FXa和FIXa进一步激活凝血酶原(FII)成为FIIa，FIIa又使纤维蛋白原变成纤维蛋白，进而与激活的血小板形成凝块(Semeraro N，Colucci M.Tissue factorin health and disease.Thromb Haemost.1997；78：759-64)。

在病理状态下，血管中凝血的形成会导致心血管疾病(如动脉硬化、心肌梗死、休克、肺部栓塞等)，而心血管疾病是现代社会最普遍的致死因素。因而，防止血液凝固已成为治疗血栓栓塞紊乱的主要目的，同时，寻找抗凝、抗血栓药物将会对上述心血管疾病的预防和治疗产生深远的意义并具有很好的应用前景。

过去大量研究都集中于血栓形成和FXa的选择性抑制剂，但最近的研究表明，TF和FVIIa复合物的抑制剂能有效的抗凝、抗血栓形成，同时和其他抗凝药相比又减少了出血的危险(Suleymanov OD et al，Pharmacological Interruption of Acute Thrombus Formation with MinimalHemorrhagic Complications by a Small Molecule Tissue Factor/Factor VIIa Inhibitor：Comparison to Factor Xaand Thrombin Inhibition in a Nonhuman Primate Thrombosis Model.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003；306：1115-21)，因此，TF或TF/FVII(a)复合物的抑制剂也有望成为新型的抗凝血药，用于病理性血栓的预防和治疗。

同时，随着对TF作用的了解加深，除了其在凝血过程中的作用，TF还承担了信号受体和其他非凝血功能。这使得它在系统性炎症、凝血紊乱、动脉粥样硬化、肿瘤的血管发生及转移，糖尿病等疾病中起重要作用。TF的生物学作用多样性已经得到证实，TF的异常表达可能影响多种疾病的病理过程，干预TF的表达可能为多种疾病的治疗、预防提供新的策略。因此，TF或TF/FVII(a)复合物抑制剂将成为抗凝、抗血栓、抗肿瘤等药物发现的一个很有吸引力的新靶点(Steffel J，Thomas F，Felix C.Tissue Factor in Cardiovascular Diseases：Molecular Mechanismsand Clinical Implications.Circulation.2006；113：722-31)。因而筛选TF或TF/FVII(a)复合物抑制剂将对病理性血栓、肿瘤等疾病的治疗产生重要意义。

要筛选TF抑制剂就需要合适的测定TF活性的方法，目前TF活性的测定方法主要有一期凝固法和发色底物法。一期凝固法需要的细胞数目多，操作较麻烦，不易进行微孔板筛选，而且稳定性差。发色底物法更为灵敏和易于操作，它是根据TF-FVIIa活化的FXa可以使发色底物分解为多肽和对硝基苯胺(PNA)，后者在405nm处有吸收高峰，利用分光光度计在405nm测OD值可反映TF的活性水平。然而过去报道的发色底物法的价格较昂贵，操作较复杂，试剂用量也较大，不适宜进行大量样本的同时测定。

发明内容

本发明公开了一种TF活性的测定方法，使其能在微孔板上实现TF或TF/FVII(a)抑制剂的高通量筛选。

本发明与现有技术相比具有以下的明显优点和技术进步：