[发明专利]异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。

背景技术

异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC1.1.1.41；EC 1.1.1.42)的作用下变成α-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，EC 4.1.3.1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。

中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D-异柠檬酸的测定方法—紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理：异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型：以NAD为辅酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP为辅酶的酶(EC1.1.1.42)，两者催化同一反应。

在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下：

D-异柠檬酸+辅酶  异柠檬酸脱氢酶  二氧化碳+

                                   酮戊二酸+还原型辅酶

二氧化碳+亚铁细胞色素  甲酸脱氢酶  甲酸+

                                         高铁细胞色素

甲酸+辅酶  甲酸脱氢酶  二氧化碳+还原型辅酶

这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)酶(偶)联甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase；EC 1.2.2.1；EC1.2.2.3)、辅酶依赖型甲酸脱氢酶(NADP-dependent formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应速率比色法。异柠檬酸脱氢酶，作为作用酶，酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，同时也是显色酶，将辅酶还原成为还原型辅酶；再通过(偶)联合甲酸脱氢酶、辅酶依赖型甲酸脱氢酶的作用，甲酸脱氢酶也作为作用酶，利用二氧化碳产生甲酸；辅酶依赖型甲酸脱氢酶又作为循环酶又是显色酶，一面将甲酸变回二氧化碳，使之不断循环利用；一面又将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液                                  100mmol/L

稳定剂                                  500mmol/L

辅酶                                    3mmol/L

异柠檬酸脱氢酶                          10000U/L