[发明专利]一种纤维蛋白溶解酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种主要利用纤维蛋白溶解酶菌株——芽孢杆菌生产纤维蛋白溶解酶的制备方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

心脑血管疾病一直号称威胁人类健康的头号杀手，据有关调查报告显示，我国每年死于心脑血管疾病的人有300多万，占我国每年总死亡人数的50％，而患病幸存下来的人中，75％不同程度丧失劳动能力，4％重残。血栓栓塞性疾病是其中致死和致残第一位原因，没有血栓就没有心脑血管事件。

临床上对血栓栓塞性疾病较常用的治疗方法主要有三种：第一，外科手术，这是去除血栓最迅速直接的方法。这种方法条件复杂，费用昂贵，目前已经较少使用。第二，保守疗法，即给患者长期服用阿司匹林、肝素和水蛭素等药物。第三，溶栓疗法，即服用或注射溶栓剂使血管开通，血栓栓塞性疾病的溶栓、抗栓疗法为新鲜血栓中的纤维蛋白成分可以被溶栓药物溶解，使堵塞的血管再通，恢复器官和组织供血，改善器官功能。这是目前使用的主要方法，致死的危险性比保守疗法降低了10％~50％。

随着溶栓剂的推广使用，血栓栓塞性病人的死亡率明显下降。溶栓剂的研究开发相当活跃，但是，在临床上使用的溶栓药均在不同程度上存在一定的缺陷；或毒性较强、副作用大；或在体内半衰期短，药效难以发挥；或来源紧缺、价格昂贵。

所以，研究人员除了致力于溶栓剂开发的同时，也在寻找天然的较具优势和发展前途的溶栓物质，微生物是溶栓药物的主要来源，如细菌、真菌、放线菌和藻类。人们分别从豆鼓中分离到产纤溶酶高活力菌株，菌种鉴定为枯草芽孢杆菌，还从一种海洋细菌中分离到了一株枯草杆菌，从链霉菌Y405发酵液中分离钝化得到一种纤溶蛋白酶SW1。这样，筛选产酶性能优良的菌种，摸索出成熟的工艺条件，对以后大规模生产至关重要。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用纤维蛋白溶解酶菌株——芽孢杆菌生产纤维蛋白溶解酶的制备方法。

本发明的技术方案是：

种子培养：种子培养基以g/100ml计为：蛋白胨1，葡萄糖1，酵母膏0.5，Na₂HPO₄  12H₂O 1.2，MgSO₄ 7H₂O 0.03，调Ph7.2，121℃灭菌20min，培养条件为：摇床转速180rpm，培养温度37℃，培养时间16～18小时；

液体发酵培养：液体发酵培养基以g/100ml计为：蛋白胨1~2.5，葡萄糖1～2.5，Na₂HPO4 12H2O 1～2.5，NaH₂PO₄ 2H₂O 0.13，MgSO₄ 7H₂O 0.1，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03，121℃灭菌20min，调pH7.2；种子培养基按体积百分5％接入装液量为15升液体发酵培养基的25升发酵罐中，培养条件为：搅拌速度180rpm，控制通风量：0～12小时为9L/min，12～24小时为10.5L/min，24～36小时为12L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间35~40小时。

酒精沉淀：把发酵液搅拌加到预冷至5～10℃乙醇中，并使乙醇浓度达60～70％，于0～5℃静置沉淀18～24小时，去除上层醇液，下层沉淀即为纤维蛋白溶解酶。

冷冻干燥：将沉淀灌袋吊滤，直至滤去大部分乙醇，再进行压榨，然后在40℃下鼓风干燥后冷冻保存。

本发明有益效果是：芽孢杆菌最初来源于发酵食品虾酱，是无人体寄生性的高度安全的菌类，通过细菌进行液体发酵生产成本低，可行性强，可用于大规模生产，直接制成胶囊、冲剂、口服液或口服含片，或作为功能性食品配料用于保健食品或普通食品中。本发明改进了以往的纤溶酶产生菌的筛选方法，采用液体培养基富集培养、以纤维蛋白为主要基质的平板初筛和摇瓶复筛的筛选方法，同时进行纤溶活性测定，得到发酵液的酶活为588.4u/ml以上(以尿素酶为标准)。

酶活定义：以同居有溶栓能力的尿激酶为标准，PH7.5，37℃条件下，1分钟内使1ML猪血纤维蛋白酶原在275nm的吸光度增加1的酶量定义为一个尿激酶酶活单位。

具体实施方式

将芽孢杆菌在下述条件下进行发酵，