[发明专利]一种黑色素瘤体外模型的制作方法

权利要求书

1.一种黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：取健康成人皮肤标本，用PBS清洗标本表面附着物，常规消毒，去除标本皮下脂肪组织层，制成1×1cm2的皮片，浸于56℃PBS中30分钟，然后去除标本表皮，将去除表皮的标本置于聚乙烯塑料瓶中，将塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分钟，取出后室温放置30分钟，依此连续10个循环后，即得HDED基质材料，将基质材料置于经灭菌处理过的六孔板上，1mL/孔加入以DMEM∶F12为3∶1的体积比配制的完全培养基，完全培养基的pH为6.8～7.0，将浓度为1.5×103个/mL的黑色素瘤细胞悬液以0.3mL/块的量接种于HDED表面，置于37℃、5％CO2环境中孵育3小时，然后每孔加入等量完全培养基，以浸没HDED为准，置于37℃、5％CO2环境中培养72小时后，调整完全培养基的量，使黑色素瘤细胞在接触空气的液面状况下生长，37℃、5％CO2环境中继续培养13天，每3～5天换液一次，即得黑色素瘤体外模型。

2.如权利要求1所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：HDED基质材料在接种前浸于DMEM中，在37℃、5％CO2环境中浸泡24h。

3.如权利要求1所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：在将黑色素瘤细胞接种前先进行黑色素瘤细胞的培养。

4.如权利要求3所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：黑色素瘤细胞的培养方法是：将黑色素瘤细胞接种于完全培养基中，于37℃、5％CO2环境中培养，每2天换液一次，待细胞长至80％融合状态时吸去完全培养基，以PBS液清洗两遍，加入0.25％胰蛋白酶铺满培养瓶底，轻摇培养瓶，消化贴壁细胞1分钟后加入完全培养基终止消化，吹打培养瓶壁上细胞，将含有细胞的混合液以800转/分的速度离心5分钟收集黑色素瘤细胞，重悬于完全培养基中制成细胞悬液，分成3～4份接种于无菌培养瓶中，于37℃、5％CO2环境中继续培养至细胞的贴壁率为85％以上。

5.如权利要求1所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：将接种黑色素瘤细胞的HDED置于37℃、5％CO2环境中液面下培养72小时后，将经过灭菌处理的支撑架置于HDED下，使黑色素瘤细胞在接触空气的液面状况下生长。

6.如权利要求1-5任一所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：所述的黑色素瘤细胞是MV3黑色素瘤细胞。

7.如权利要求1或4所述黑色素瘤体外模型的制作方法，其特征在于：所述完全培养基中再加入胎牛血清，以体积比计算，胎牛血清的加入量为DMEM∶F12∶胎牛血清为3∶1∶0.44，以NaHCO3溶液调节pH至6.8～7.0。