[发明专利]一种黑色素瘤体外模型的制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黑色素瘤体外模型的制作方法，特别是涉及以人工皮肤为基质材料制作黑色素瘤体外模型的方法。

背景技术

恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)简称恶黑，是由皮肤和其它器官的黑素细胞、痣细胞所发生的一种恶性程度极高的肿瘤。MM占全身癌症发病率的2％，占皮肤恶性肿瘤的第三位(6.8～20％)。许多国家恶性黑色素瘤的发病率呈逐年上升趋势，尤其是发达国家，发病率明显上升。在最近的50年里，黑色素瘤的发病率增加了1000％，某些学者认为这可能是由于暴露紫外线增加的结果。由于恶性程度高，早期即可以发生转移，进展期的黑色素瘤患者平均生存期仅有6～9个月，MM越来越威胁人们的健康和生命。

侵袭和转移是恶性肿瘤最主要的生物学特征，也是恶性肿瘤生长过程中必然出现的生物学现象，它不仅贯穿于原发恶性肿瘤的自然病程，而且存在于新转移瘤的发生、生长的各个环节，直接影响肿瘤患者的预后。目前对于恶性肿瘤的侵袭和转移机制尚未十分明了，多年来一直是国内外医学界研究的焦点之一。以往对于恶黑浸润和转移的研究主要通过人体、动物及细胞系进行的，但是人体实验对机体会产生不同程度的影响，动物实验会导致动物器官损害甚至死亡，而细胞系不能完全反映肿瘤在体的生物学特性。为此，近年来人们试图在体外建立人工肿瘤组织和器官模型用于抗肿瘤研究工作。由于这方面的研究涉及到需要特定的种子细胞和基质材料，而建立的人工肿瘤组织模型应符合在体肿瘤组织的某些特点，有一定难度，目前内外该领域研究均处于探索研究阶段。

1999年Maaser K(Mol Biol cell，1999；10：3067-3079)等报道用异种来源的牛皮肤胶原构建三维胶原基质，并在此基础上种植MV3恶性黑色素瘤细胞取得成功。并用这种黑色素瘤模型研究恶性黑色素瘤的侵袭与转移能力，这项研究显示在三维胶原基质中启发肿瘤细胞运动的机制与平面培养体系是有差异的，三维胶原基质培养体系更符合肿瘤细胞在机体内的微环境。2000年Eves P(British J Dermatol 2000；140；210-22)用人的去细胞的真皮组织(de-epidermized acellular human dermis，简称DED)作为基质材料，体外培养的黑色素瘤组织取得成功。去表皮的无细胞真皮制作方法为：外科切除的皮肤在蒸馏水中漂洗六遍，浸入一个封闭容器，在振动水浴箱放10分钟，将水倒出，重复此操作两遍。皮肤的真皮面朝上，夹在铝箔中放入一个90mm培养皿中20℃冷冻，30min后放在冷冻干燥机中过夜，之后，冷冻干燥后的皮肤被转移到聚乙稀袋中密封。后用15％乙烯氧化物和85％二氧化碳混合物在高压灭菌，持续20～30分钟，后用1mol/L氯化钠处理6～8小时以除去表皮，用镊子将表皮从下面的真皮分离出来。他们使用的黑色素瘤种子细胞为来自结节性黑色素瘤淋巴结转移的HBL细胞系，该黑色素瘤种子细胞是专属于Ghanem’s实验室。使用该方法种植黑色素瘤种子细胞时需用特定金属环固定。尽管前述技术提供了体外研究皮肤黑色素瘤的立体模型，但是仍然存在一些明显不足：

1、由于Maaser K的皮肤黑色素瘤所用基质材料是用异种牛皮提取的胶原，是否符合人皮肤组织特性尚待进一步考证。

2、尽管Eves P用人的去细胞的真皮组织(DED)作为基质材料，然而也有一些技术问题值得商榷，比如(1)DED制做比较复杂，用1mol/L氯化钠处理6～8小时后的真皮表面基底膜成分未有检测说明；(2)黑色素瘤种子细胞专属于Ghanem’s实验室，来源受限；(3)在黑色素瘤种子细胞种植过程中，为防止种子细胞脱离，需用特定金属环固定，给实际操作带来了不便，并且不能确保种子细胞粘付于DED。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服以往技术的不足，制作一种以人工皮肤为基质材料的恶性黑色素瘤体外模型，用于肿瘤的侵袭性和转移的研究。

本发明解决上述技术问题的思想是：首先建立一个含有基底膜成分的三维基质材料，即人的去表皮的真皮组织(human de epidermized human dermis，简称HDED)，然后将MV3恶性黑色素瘤细胞株作为肿瘤种子细胞，按照一定的接种密度，种植于HDED表面，通过空气一液面孵育、液下培养和空气一液面培养相联合的方式，使黑色素瘤细胞容易粘着并种植于HDED表面，有利于生长，进而构建更为贴近人类机体微环境的皮肤恶性黑色素瘤的体外模型，最后用组织学方法观察这个模型中MV3恶性黑色素瘤细胞的侵袭性生长情况。

本发明具体采用的技术方案如下：