[发明专利]一种仙人掌类植物DNA的提取和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取和纯化方法，特别是涉及提取DNA时会产生粘液的仙人掌类植物DNA的提取和纯化方法。

背景技术

仙人掌主要分布于美洲热带地区，目前世界上已知的有2000种以上，其中以墨西哥最多，我国的西南和华南沿海地区也有少数野生的仙人掌植物。近十几年来通过引种栽培，仙人掌植物在我国已逐年增多。主要分布在我国南部。由于食用和果用仙人掌类植物的市场需求不断增加，为了更好的利用和保护这些资源，大量的研究工作正在展开，这些研究工作包括揭示其种间亲缘关系、遗传多样性以及分子标记育种等，进行这些研究的前提是得到纯度较高的DNA。但是，仙人掌类植物中含有粘液物质，采用标准的CTAB方法提取DNA会受到粘液物质的干扰，得不到很纯的DNA，不能满足研究的需要。如何从含有粘液物质的仙人掌类植物中提取纯度较高的DNA是分子生物学研究人员急待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能有效的从含有粘液的仙人掌类植物中提取和纯化DNA的方法，该方法可以有效的克服粘液物质的干扰，提取的DNA的纯度可以达到进一步研究的需要。

为了解决上述技术问题，本发明提供的提取和纯化方法为：将经过预处理的试样于液氮中磨成粉末，加入65℃的细胞裂解液后置65℃水浴中保持，然后离心，吸取上清液，加入4℃饱和酚溶液和常温氯仿，离心，吸取上清液，加入4℃乙酸钾溶液和-20℃异丙醇，置于-20℃的冰柜中进行沉淀，吸取团状DNA沉淀用70％乙醇洗涤并风干，然后沉淀用4℃TE缓冲液充分溶解，溶解后加入4℃饱和酚和常温氯仿，重复从第二次离心至风干沉淀的操作一次，所得沉淀用4℃TE缓冲液溶解即得DNA的TE溶液。

具体的操作步骤如下：

(1)取5～8g经过预处理的试样于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速转移至1.5ml离心管中；

(2)立即加入65℃预热的细胞裂解液600μl，置于65℃水浴中保温50～70分钟，其间每隔5～10min轻摇1次，将裂解样离心18～22分钟，吸取上清液于离心管中；

(3)在步骤(2)的离心管中加入上清液同体积的4℃饱和酚溶液和常温氯仿，轻摇8～12分钟，以12000r/min离心18～22分钟；

(4)吸取上清液于1.5ml离心管中，加入上清液体积0.1倍的4℃乙酸钾溶液和上清液同体积的-20℃异丙醇，放置于20℃的冰柜中18～22分钟；

(5)吸取离心管中的团状DNA沉淀于1.5ml离心管中，用70％乙醇洗涤沉淀2次，风干沉淀；

(6)沉淀用4℃TE缓冲液溶解，在4℃保存2小时使DNA充分溶解；

(7)重复(3)～(5)的操作一次，沉淀加4℃TE缓冲液300μl溶解，保存于4℃的冰箱备用。

优选地，仙人掌类植物DNA的提取和纯化方法如下：

(1)取5～8g经过预处理的试样于液氮中迅速研磨成粉末，然后快速转移至1.5ml离心管中；

(2)立即加入65℃预热的细胞裂解液600μl，置于65℃水浴中保温1小时，其间每隔5～10min轻摇1次，将裂解样离心20分钟，吸取上清液于离心管中；

(3)在步骤(2)的离心管中加入上清液同体积的4℃饱和酚溶液和常温氯仿，轻摇10分钟，以12000r/min离心20分钟；

(4)吸取上清液于1.5ml离心管中，加入上清液体积0.1倍的4℃乙酸钾溶液和上清液同体积的-20℃异丙醇，放置于-20℃的冰柜中20分钟；

(5)吸取离心管中的团状DNA沉淀于1.5ml离心管中，用70％乙醇洗涤沉淀2次，风干沉淀；

(6)沉淀用4℃TE缓冲液溶解，在4℃保存2小时使DNA充分溶解；

(7)重复(3)～(5)的操作一次，沉淀加4℃TE缓冲液300μl溶解，保存于4℃的冰箱备用。

其中，前述细胞裂解液为2％CTAB细胞裂解液，其配制方法为：在去离子水中加入CTAB4g、NaCl 16.364g和1mol/l的Tris-HCl 20ml，充分溶解，定容至200ml。

所述饱和酚的pH值为8.5。

所述乙酸钾溶液是浓度为3mol/l、pH值为5.2的乙酸钾水溶液。