[发明专利]具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制备S－型盐酸倍他洛尔中的应用

权利要求书

1.一株从土壤中筛选的微生物菌种，其特征在于，该菌株为粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，能产生立体选择性脂肪酶，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC.No.2257。

2.如权利要求1所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在制备S-型盐酸倍他洛尔中的应用，其特征在于，通过如下步骤：

(1)将粘质红酵母CGMCC.No.2257在如下条件下进行培养、发酵，获得细胞培养液或湿菌体或固定化细胞，将其作为酶制剂；

(a)斜面培养基为：葡萄糖0.5～5％，蛋白胨0.1～5％，酵母膏0.1～5％，琼脂2％；

(b)种子及发酵培养基为：葡萄糖0～5％，蛋白胨0～5％，玉米浆1～5％、蛋白胨0.1～5％、甘油1～5％，初始pH 5～10；

(c)培养条件为：温度20～50℃，时间5～48h，装液量系数10～60％；

(2)将上述酶制剂接种于组成为：玉米浆0.5～5％、蛋白胨0.1～5％、甘油0.5～5％，初始pH 4～10培养基中，于20℃～50℃培养12～48h，然后加入4-(2-乙酰氧基-3-(N-(异丙基)-N-乙酰基氨基)丙氧基苯乙醇乙酸酯0.5～12g/L做为底物，于20℃～50℃转化5～50h，生成中间转化产物，中间转化产物用HPLC法测定转化率和产物ee值；

(3)合成S-型盐酸倍他洛尔：

在中间转化产物中加入适量的甲醇和过量的氢氧化钠，反应5～50分钟，然后除去甲醇，用乙酸乙酯萃取水相得到脱乙酰化产物；

在脱乙酰化产物中加入甲苯、苯甲醛和对甲苯磺酸，充入氩气，油浴下回流，冷却后用水洗涤，将有机层用硫酸钠干燥，在减压下蒸去甲苯得氨基乙醇衍生物；

将氨基乙醇衍生物溶于无水DMF中，加入NaH，常温下反应1～30分钟，加入溴甲基环丙烷后于0℃～-50℃反应1～10h，然后在常温下反应1～5h，把反应液倒入适量的碳酸氢钠饱和溶液中，除去NaOH再用氯仿萃取，减压蒸馏除去氯仿得到S-倍他洛尔；

将S-倍他洛尔用适量异丙醇溶解，滴加两倍当量的浓盐酸，减压蒸馏除去异丙醇，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤产物，用氯仿洗涤水层，减压下蒸馏除去氯仿，得到淡黄色液体，再用石油醚-丙酮混合体系进行重结晶，即得S-型盐酸倍他洛尔。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤(1)中所述固定化细胞用海藻酸钠、聚乙烯醇和活性碳进行固定化，并用聚乙烯亚胺进行强化处理，海藻酸钠用量1～5％、聚乙烯醇用量0～5％、活性碳用量0～5％，聚乙烯亚胺浓度0.1～5％。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤(2)中用细胞培养液直接进行转化，底物浓度为1～10g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50h。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：在转化体系中加入甲苯、正己烷、氯仿有机溶剂以提高转化速度，有机溶剂加入量为1～10％。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤(2)中用静息细胞在pH 5～10的缓冲液中进行转化，缓冲体系为Na₂HPO₄-柠檬酸、Na₂HPO₄-KH₂PO₄、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、K₂HPO₄-KH₂PO₄，底物浓度为1～10g/L，转化温度为20～50℃，转化时间为5～50h。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤(2)中固定化细胞用在填充床反应器中进行转化，填充床反应器尺寸为10～50×100～500mm，通过恒温箱20℃～50℃保温；底物浓度1～10g/L，底物溶液由反应柱上部或下部流入，反应后的转化液从反应器另一端收集。

8.如权利要求1所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在手性化合物拆分中的应用，其特征在于，利用该微生物进行手性中心含有酰基、羟基类化合物的手性拆分。