[发明专利]具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制备S－型盐酸倍他洛尔中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株酵母菌及其应用，尤其涉及一株具有立体选择性脂肪酶活的酵母菌及其在生物拆分法制备S-盐酸倍他洛尔中的应用。

背景技术

青光眼是一种发病迅速、危害性大、随时导致失明的常见疑难眼病。近年来发病率有所上升，据世界卫生组织统计，目前全球青光眼患者约为6700万，约450万人因青光眼而失去视力，在我国，年龄大于40岁的人群中，原发性青光眼的发病率1％～2％，以全国13亿人口计，原发性青光眼患者已超过700万，青光眼已成为我国第二大眼科常见疾病，约占眼科疾病的14.36％。统计数据表明青光眼已成为第二大致盲因素。目前青光眼的临床治疗以手术和药物治疗为主。手术只是暂时降低眼压，对于某些类型的青光眼只能缓解症状，最终还是以失明告终。治疗青光眼药物主要包括拟副交感神经药、拟肾上腺素药、肾上腺素受体阻滞剂、碳酸酐酶抑制剂、高渗脱水剂等。其中首选药物肾上腺素受体阻滞剂如噻吗洛尔、倍他洛尔等，但这些药物容易引起支气管痉挛、心动过缓、增加心脏阻滞、降低血压等副作用，目前国外已不再将其作为首选药物。

左旋倍他洛尔是倍他洛尔的左旋体，它对β₁受体的亲和性远远高于其消旋体，这种高选择性使其对具有心肺疾病的患者更为安全，它副作用也非常小，且不具有膜稳定(局部麻醉)作用和内源性拟交感胺作用。左旋倍他洛尔对眼纤毛上皮的β₂受体也有较高的亲和力，可以减少房水的生成而降低眼内压，还可通过阻滞L-电压依赖性钙离子通道保护视神经免受多种伤害。动物实验表明左旋倍他洛尔产生的降低眼内压效应比倍他洛尔要强1-2mmHg，也有报道称左旋倍他洛尔降低眼内压的能力比其右旋体强25.9％左右，其有效期也比外消旋体和右旋体要长得多。眼用倍他洛尔最常见的副作用是有刺激性，通过使用效果相同但浓度减小的眼药水可使这一副作用减至最小。国外已有左旋盐酸倍他洛尔的滴眼剂上市，商品名为“Betoptic S”，主要用于治疗慢性开角型青光眼或高眼压病人降低眼内压。

Ramesh A.Joshi研究组于2005年报道了用化学合成法制备S-倍他洛尔的工艺，并申请了几篇与此工艺有关的专利，这些工艺或者需要昂贵的试剂，或者需要昂贵的催化剂。

自从微生物转化应用于生产后，一般以化学法与微生物转化相结合来制备手性药物。生物催化拆分反应立体选择性和区域选择性强，反应条件温和，可避免或减少使用强酸、强碱和一些有毒原料，改善操作条件，减少环境污染；可避免使用不对称合成中所必需的昂贵的手性试剂或手性催化剂。生物催化剂生产成本低廉，可大规模生产，生产周期短，不受季节影响，且催化剂可重复利用，进一步降低成本。

Giuseppe DB等人于1995年报道了化学-酶法制备S-倍他洛尔的方法，他们用于催化手性拆分反应的是一些微生物脂肪酶。其中效果最好的是假单胞菌脂肪酶AK，该反应在特丁基甲基醚介质中反应，反应体系闪点低，易燃，存在安全隐患；酶和底物重量比1∶7，催化剂成本很高；他们的光学纯度仅能达到80％(拆分收率50％)，通过对其盐酸盐重结晶才使ee值达到90％。其它微生物酶催化的反应立体选择性要差得多，且酶-催化剂重量比为1∶1，催化剂成本更高。另外，他们没有报道酶的稳定性，也没有有关细胞或酶固定化的报道，距离工业化的要求尚远。筛选立体选择性强、催化效率高且稳定性好微生物酶，并在此基础上探索催化成本低的生产S-盐酸倍他洛尔的新工艺并拥有自主知识产权为我国目前制药行业所迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种立体选择性强、催化效率高且稳定性好的酵母菌；另一目的在于以该酵母菌为催化剂，提供其在生物拆分法制备S-型盐酸倍他洛尔中的应用。

本发明中的酵母菌能产生具有立体选择性的脂肪酶，其特征在于可对手性中心含有酰基的化合物进行对映体拆分。该酵母菌为粘质红酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，已于2007年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路)，保藏编号CGMCC.No.2257。

该酵母菌的筛选包括以下步骤：

(1)以底物为唯一碳源进行富集培养和平板分离，得到能作用于底物的菌种。

(2)通过对转化产物进行TLC和旋光测定，筛选转化产物中含有新化合物并且旋光值为负的菌种。

(3)通过鉴定产物的结构最后确定能转化底物为预期产物的菌种。

(4)对菌种进行鉴定。