[发明专利]一种指状青霉的根癌农杆菌介导的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种青霉菌的遗传转化方法，尤其涉及一种指状霉菌的根癌农杆菌介导的遗传转化方法。

背景技术

青霉属(Penicillium)真菌种类繁多，有的在医药和工业上具有重要的经济价值，如产黄青霉菌(P.chrysogenum Thom)和特异青霉(P.notatumWestling)能产生青霉素，为人类健康作出的重大贡献；灰黄青霉(P.griseofulvum)等可提取灰黄霉素等。然而，青霉属真菌中的一些种却是人类的重要病原菌，如马尔尼菲青霉菌(P.marneffei)为深部真菌感染性疾病的元凶，被认为是东南亚地区艾滋病患者最常见的机会性感染之一。

该属真菌中的不少种类则寄生或腐生在水果、蔬菜、粮食、肉类和其他食物上，不仅引起这些食品的腐烂和霉变，其产生的毒素还危急人类的健康。黄绿青霉(P.citreoviride Biourge)、桔青霉(P.citrinum Thom)和岛青霉(P.islandicum Sopp)能引起大米霉变，产生“黄变米”，它们产生的毒素如黄绿青霉素(citreoviridin)对动物神经系统有损害；桔青霉素(citrinin)能损害肾；岛青霉产生的黄天精、环氯素和岛青霉素均为肝脏毒。

指状青霉菌(P.digitatum)是引起贮藏期柑橘腐烂的最重要病原菌。通常采后柑橘因腐烂损失达20-30％，而其中的90％以上是由指状青霉菌或意大利青霉菌(P.italicum)所引起。为有效控制指状青霉菌对柑橘等水果造成的损失，有必要从分子水平上深入研究该病菌的致病机制、生长发育规律和杀菌剂的有效靶点，而一套有效的遗传转化体系则是开展指状青霉菌分子生物学研究的前提。指状青霉菌遗传转化体系的建立，不仅为指状青霉菌的分子生物学研究奠定基础，同时也为青霉属下的其他种的分子生物学、基因工程提供参考。

自从报道的遗传转化方法以来，所有国内外所报道的青霉菌的遗传转化体系均是利用通过制备原生质体，通过氯化钙-PEG介导技术来实现。原生质体的制备和再生繁琐、费时，而且受多种因素的影响，再生率低，重复性差。

根癌农杆菌是一种革兰阴性土壤杆菌，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将其Ti质粒上的T-DNA转入植物细胞并整合到植物的基因组，最终导致植物肿瘤的发生。因为这一机制，根癌农杆菌及其Ti质粒进行一系列的改造，成为植物细胞转化的载体，而且一直沿用至今。

Bundock等首次采用根癌农杆菌介导的方法进行了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的转化(Bundock，p.Dulk-Ras，A.Beijersbergen，A.G.M.，Hooykaas，R.J.J.(1 995)Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacterium tumefaciens to saccharomyces cerevisiae.EMBO J.1 4，3206-3214)；de Groot等首先利用根癌农杆菌介导的方法成功地实现了丝状真菌的遗传转化(de Groot，M.J.A.，Bundock，p.Hooykaas，R.J.J.，A.Beij ersbergen，  A.G.M.(1 998)Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation of filamentous fungi.Nat.Biotechnol.16，839-842)。这些开创性的工作为丝状真菌的遗传转化开辟了一条全新而有效的途径。根据Michiese等的统计，目前通过该方法实现转化的丝状真菌已有60余种。然而，迄今尚未有关根癌农杆菌介导的青霉菌的遗传转化方法。

将来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC启动子替代用于转化植物的双元载体pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子，获得含潮霉素B抗性基因的载体pTFCM(李模孝华中农业大学2004届硕士论文盾壳霉T-DNA标记插入突变体库的构建及其质量评估)。

中国专利申请200410084578.6公开了一种根癌农杆菌介导的顶头孢霉的转化方法，包括以下步骤：

(1)构件重组载体质粒；

(2)通过电激法和三亲杂交法将载体质粒导入根癌农杆菌中，构建含有双元载体系统的根癌农杆菌；

(3)将含有双元载体系统的根癌农杆菌与顶头孢霉共培养，得到转化子；

(4)获得的转化子以耐抗生素进行筛选。