[发明专利]均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法

权利要求书

1.均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂为：N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；其结构式如下：

2.如权利要求1所述的均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂的制备方法，其步骤和条件如下：    

(1)N-氧化-2，6-二溴吡啶的合成

向三口反应器中加入2，6-二溴吡啶和质量浓度为30％的过氧化氢，2，6-二溴吡啶与过氧化氢摩尔比为1∶3，再加入与2，6-二溴吡啶摩尔比为(14∶1)～(15∶1)的三氟乙酸，35～42℃搅拌反应1～5h，冷却至室温，倒入蒸馏水中，冷却至-5～0℃，抽滤，滤液用无水Na₂CO₃中和pH值至9～11之间，用氯仿萃取，合并有机相，蒸除溶剂，得到白色固体产物N-氧化-2，6-二溴吡啶；

(2)N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶的合成

将摩尔比为1∶16的N-氧化-2，6-二溴吡啶和质量浓度为98％的浓H₂SO₄互溶，搅拌下加入体积比为2∶1的上述浓H₂SO₄和发烟硝酸的混合酸，升温至80～100℃，搅拌1～3h，冷却后倒入碎冰中，抽滤，真空干燥，得浅黄色固体产物N-氧化-2，6-二溴-4-硝基吡啶；

(3)2，6-二溴-4-氨基吡啶的合成

室温搅拌下向N-氧化-2，6-二溴吡啶中加入冰醋酸，冰醋酸与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为(82∶1)～(88∶1)，再加入与N-氧化-2，6-二溴吡啶摩尔比为7∶1的还原铁粉，80～110℃反应0.5～2h，得到的灰白色稠状物，用饱和NaOH溶液调节pH值为9～11，冷却，用乙醚萃取，合并有机相，回收乙醚，得到白色固体产物2，6-二溴-4-氨基吡啶；

(4)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶的合成

将3-甲基吡唑溶于二甘醇二甲基醚中，3-甲基吡唑与二甘醇二甲基醚的摩尔比为1∶4，搅拌下加入金属钾，升温至60～80℃继续反应，待钾全部溶解后加入2，6-二溴-4-氨基吡啶，其中3-甲基吡唑、金属钾和2，6-二溴-4-氨基吡啶的摩尔比为4∶4∶1，在160～170℃下反应80～100小时，冷却，抽滤，减压蒸除滤液中溶剂，搅拌下加入蒸馏水，抽滤得浅黄色粉末，用体积比为2∶1的氯仿∶正己烷溶液提取，合并提取液，过滤，浓缩后冰盐浴冷却下重结晶，得到白色针状晶体2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-氨基吡啶；

(5)2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶的合成

向反应器中加入NaNO₂、H₂SO₄和2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶，三者的摩尔比为1∶40∶1，其中2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶用醋酸溶解，并滴入反应器中，35～40℃下反应-小时，降温至-10～-5℃，将CuBr用HBr溶解，加入到反应器中，CuBr与2，6-二(3-甲基-1-H-吡唑)-4-氨基吡啶摩尔比为2∶5，在-10～-5℃反应半小时，再升温至40～60℃，反应-小时，然后降温至0～-7℃，用质量浓度为50％的NaOH溶液中和pH值为9～11，用氯仿萃取，蒸干溶剂，产物用氯仿∶甲醇体积比为2∶1的混合溶液重结晶，得黄色结晶2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶；

(6)2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶的合成向三口反应器中加入2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶和N-溴代琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶2，其中2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶用CCl₄溶解，再加入与2，6-双(3-甲基-1H-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为1∶109的过氧化苯甲酰，光照，回流反应0.5～2h，抽滤，对滤液进行蒸馏，得到的固体用氯仿为淋洗剂进行柱分离，得白色固体产物2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶；

(7)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)的合成

向反应器中加入碳酸钠、亚氨基二乙酸二乙酯和2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶，三者的摩尔比为10∶2∶1，再加入与2，6-二(3’-溴甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶摩尔比为(77∶1)～(192∶1)的无水乙腈，搅拌，回流20～24h，抽滤，回收滤液中溶剂，剩余部分溶于氯仿中，水洗氯仿溶液，有机相用无水硫酸钠干燥后蒸除溶剂，剩余油状物柱分离，柱分离的淋洗剂为体积比为3∶1的乙酸乙酯∶正己烷混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)；

(8)N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)的合成

在氮气气氛下，向反应器中加入N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)、对氨基苯乙炔、四(三苯基膦)钯(0)和CuI，四者的摩尔比为20∶40∶1∶20，其中N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基-1’-吡唑基)-4-溴吡啶]四(乙酸乙酯)用甲苯溶解，回流反应2～5h，过滤除去无机成分，滤液倒入甲醇中，收集沉淀，溶于四氢呋喃中，用甲醇重结晶，经硅胶G柱层析纯化，淋洗剂为体积比为3∶1的正己烷和四氢呋喃混合溶液，得产物N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)；

(9)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成

N，N，N’，N’-[2，6-二(3’-氨甲基)-1’-吡唑基)-4-氨基苯乙炔-吡啶]四(乙酸乙酯)溶于与其摩尔比为225∶1的三氟乙酸中，室温搅拌1～3h，减压蒸发除去三氟乙酸，再经乙酸酐处理，滤出沉淀，得N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸；

(10)N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-异硫氰基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸的合成

N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸溶于H₂O中，用固体NaHCO₃调pH至7～9，取二氯硫化碳溶于CHCl₃中，二氯硫化碳与CHCl₃的摩尔比为1∶354，其中N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸与二氯硫化碳的摩尔比为1∶1，滴加，室温搅拌，当游离氨检测为阴性时，中止反应，分离出水相，蒸发浓缩，Florisil柱层析纯化，乙腈/水洗脱，得最终产物N，N，N’，N’-[[2，6-二(3’-氨甲基)-1-吡唑]-4-(4-氨基(苯基乙炔)-吡啶)]-四乙酸。