[发明专利]一株对氧还循环反应剂高敏感的大肠杆菌的构建及应用

权利要求书

1.一种对于氧还循环反应剂敏感的大肠杆菌菌株，其特征在于，名称为E.coli WMC-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心，编号CGMCC No.1867。

2.根据权利要求1所述的对于氧还循环反应剂高敏感的大肠杆菌菌株E.coli WMC-001，其特征在于，该菌为多基因突变株。

3.根据权利要求2所述多基因突变菌株，其特征在于，利用基因敲除技术，敲除E.coli MC4100基因组中编码分解超氧化物的酶(sodA和sodB)和分解过氧化物和过氧化氢的酶(katG和ahpCF)及生成内源性超氧化物和过氧化氢的酶(frdABCD)。

4.根据权利要求3所述多基因突变株的构建方法，其特征在于，利用条件复制质粒pKOV作为工具，重组频繁的E.coli MC4100为研究对象，通过同源重组的方法顺序敲除frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA。

5.根据权利要求4所述多基因突变株的构建方法，其特征在于，重组片断的构建利用交叉PCR扩增出含有基因两端同源臂的PCR片断，frdABCD PCR片断构建。

6.根据权利要求4所述五个基因的敲除的方法，其特征在于，用于基因敲除的打靶载体，包括pKOV-sodA、pKOV-sodB、pKOV-katG、pKOV-ahpCF及pKOV-frdABCD，，其中以pKOV-frdABCD为例其载体构建。

7.根据权利要求4所述多基因突变株的构建方法，其特征在于，基因敲除的步骤以frdABCD的敲除为例：将权利要求5所述打靶载体pKOV-frdABCD转化入E.coli MC4100，通过两次同源重组，最后将frdABCD替换。

8.根据权利要求3、4、5、6、7所述多基因突变株的构建方法，其特征在于，利用同样的原理，依次将frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA敲除，最终形成frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA五个基因缺失的多基因突变菌株，命名为E.coli WMC-001。

9.根据权利要求8所述构建的多基因突变株E.coli WMC-001，其特征在于，这个菌株对于典型氧还循环反应剂百草枯(paraquat，PQ)、维生素K3(vitamin K-3，VitK3)和吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)的敏感性明显高于野生菌MC4100，并且在几个突变菌株中E.coli WMC-001的敏感性是最高的。

10.根据权利要求9所述对于氧还循环反应剂高敏感突变菌株E.coli WMC-001，其特征在于，这个敏感菌株的构建解决了生物监测氧还循环反应剂时细菌本身灵敏度不高的问题，能够在灵敏地检测氧还循环反应剂的生物传感器的研究中得到应用。