[发明专利]一株对氧还循环反应剂高敏感的大肠杆菌的构建及应用

说明书

技术领域

本发明要求保护的技术方案涉及一种通过分子生物学手段，利用代谢工程改造的细菌，具体的说是一株对氧还循环反应剂高敏感的大肠杆菌菌株、构建方法及其在检测氧还循环反应剂的生物传感器研究中的应用。

背景技术

研究显示，氧化应激参与了神经退行性变、癌症和衰老等的发生过程。其中，主要因素之一就是氧还循环反应剂(redox cycling reagents)，这类物质在细胞内经过氧化还原循环反应产生活性氧簇(ROS)而参与上述疾病的发生发展。氧还循环反应剂在一些酶的催化下，被还原当量NADH/NADPH所还原发生单电子传递反应，将电子传递给分子氧生成超氧阴离子(见图1)。超氧阴离子产生的过程是：(1)在硫辛酸脱氢酶的催化下，氧还循环反应剂(R⁺⁺)被还原(R⁺)；(2)被还原的氧还循环反应剂(R⁺)将电子传递给分子氧生成超氧阴离子，而本身又被重新氧化为原来的状态(R⁺⁺)。硫辛酸脱氢酶是一类普遍存在的黄素酶，在大肠杆菌中至少有三种这类酶，其中的两种酶已经被鉴定，它们是：硫氧还蛋白还原酶和NADPH：铁氧还蛋白还原酶。在哺乳动物细胞这类酶主要包括：微粒体NADPH-细胞色素P-450还原、黄素嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶。上述网络反应就是在硫辛酸脱氢酶和氧还循环反应剂的催化下，NADPH迅速氧化分子氧生成超氧阴离子。总之，细胞暴露在氧还循环反应剂下有两个主要的后果：1)细胞内大量还原当量NAD(P)H的消耗；2)细胞内过氧化物的大量生成。

氧还循环反应剂是主要的工农业污染物之一，对于工农业污染物的监测已经发展了一些物理化学方法，质谱仪、气相色谱仪及其它现代化的仪器无疑为污染物的精确监测提供了强有力的技术，但是，这些物理化学方法需要昂贵的仪器和专门的实验室，更重要的是，这些技术虽说能够精确定量污染物，但是不能提供这些污染物的生物有效度、细胞内潜在的修饰/去毒作用以及体内的协同/拮抗效应等生物学关键信息。因此，有必要发展一种生物传感器来对这些有毒物质进行检测。在过去的十几年里，利用生物检测技术来检测特殊污染物的研究引起了广泛的关注，生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：1)针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；2)由感应器控制的启动子；3)受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。至今，已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物如：重金属、甲苯及其衍生物和其它物质检测的生物传感器。

现在已经比较清楚大肠杆菌针对氧还循环反应剂反应的分子机理。两种氧还反应转录因子，SoxR和OxyR，主要负责介导细胞对氧还循环反应剂的反应。SoxR包含两个结构域：N端螺旋-转折-螺旋DNA结合域和C端的调节域。SoxR C端的四个半胱氨酸残基(Cys)作为铁硫中心(2Fe-2S)的配体。纯化的SoxR是一同源二聚体，每一单体包含一个铁硫中心(2Fe-2S)。在普通培养条件下，细菌中SoxR(2Fe-2S)处于还原状态，无任何转录活性。当在培养基中加入氧还循环反应剂时，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目标基因soxS的表达。其产物SoxS是Ara-C相关转录激活子，能诱导36种基因的表达，其中包括含有Mn-超氧化物歧化酶(SODA)、核酸内切酶IV、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、延胡索酸酶C、乌头酸酶A和NADPH-铁氧还蛋白氧化还原酶等基因。

OxyR是大肠杆菌中另一种主要的氧还转录因子。与SoxR不同，OxyR含有两个氧还活性半胱氨酸残基(Cys199和Cys208)。OxyR氧化和还原状态的调节域的晶体结构显示这两个氧还活性半胱氨酸残基之间大约相隔17。在氧化状态下，二硫键的形成导致OxyR调节域结构的显著改变。OxyR二硫键可逆的形成被认为代表细胞内感受过氧化氢的一种机制，然而，也有人认为OxyR有其它的激活机制。因为部分由氧还循环反应剂刺激细胞产生的超氧阴离子被转化为过氧化氢，所以OxyR在大肠杆菌内也被氧还循环反应剂所激活。活化的OxyR刺激一大类基因的表达，其中包括过氧化氢酶I(katG)、谷氨酰氧还蛋白I(grxA)、烷基过氧化氢还原酶大亚单位(ahpF)和铁氧还蛋白2(trxC)等基因。