[发明专利]猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法

权利要求书

1、一种猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：从LPS活化的猪外周血单个核细胞PBMC提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-10编码基因，将其连接到克隆载体上，克隆pIL-10基因，将pIL-10编码基因亚克隆到表达载体pPROEXTM HTb中，转化DH5α后，用IPTG诱导培养，表达了具有活性的重组pIL-10。

2、如权利要求1所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的总RNA的提取过程为：从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，将得到的细胞在RPMI1640完全培养基中培养0.5小时，然后加入LPS继续培养5小时，然后取培养细胞用Trizol试剂盒提取总RNA。

3、如权利要求2所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的RPMI1640完全培养基为RPMI+10％胎牛血清。

4、如权利要求1所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述RT-PCR方法过程为：先取总RNA 3μL加入适量Oligo(dT)、dNTP、10×buffer(RAV)、RNasin、AMV反转录酶，42℃作用1小时，合成IL-10cDNA；然后取cDNA 2μL加入适量P1、P2、dNTP、10×buffer、ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件为95℃预加热5min，然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸10min，扩增结束后取5μL混合物用2％琼脂糖凝胶电泳。

5、如权利要求4所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：用RT-PCR方法生产的产物需要进行酶切鉴定，鉴定过程如下：取50μL PCR产物用1％低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段，悬溶于30μL TE溶液，取8μL用EcoRV酶切鉴定。

6、如权利要求1所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：所述的克隆pIL-10基因过程为：取PCR回收产物用BamHI和HindIII双酶切，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段，pUC18同样用BamHI和HindIII双酶切回收纯化，取酶切处理的1μL pUC18质粒、4μL IL-10PCR产物、1μL T4DNA连接酶和1μL10×连接酶buffer，16℃进行12小时连接反应，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，提取质粒。

7、如权利要求6所述的猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，其特征在于：克隆之后需要进行克隆鉴定及序列测定，将提取的质粒用BamHI和HindIII双酶切和PCR分别鉴定并筛选阳性克隆。