[发明专利]猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及PIL-10基因的一种应用及其制备方法，具体地说涉及到PIL-10基因在作为到猪疫苗的佐剂时的制备方法。

背景技术

迄今为止，许多传染性疾病尚未得到有效防治，现行的灭活疫苗或弱毒疫苗等传统疫苗或免疫效力低下，或存在安全性问题，促使人们开发安全有效的新型疫苗，基于重组DNA技术的基因工程疫苗安全可靠、易于鉴别诊断，具有很大的应用前景，但其抗原性一般较弱，需要有效的免疫佐剂以增强其保护效力，PIL-10是一种很好的免疫调节因子，可是在猪疫苗中使用的时候它尚未有明确的制备方法。

发明内容

本发明的目的是：本研究构建的高效表达pIL-10的基因工程菌株，对于研究pIL-10在猪各种疾病中的免疫调节作用，以及开发治疗免疫功能紊乱的免疫调节剂及某些炎性疾病的抗炎防治剂，无疑具有很大的应用价值。

本发明的技术方案为：一种猪疫苗使用的PIL-10基因佐剂的制备方法，从LPS活化的猪外周血单个核细胞PBMC提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-10编码基因，将其连接到克隆载体上，克隆pIL-10基因。

优选的是：所述的总RNA的提取过程为：从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，将得到的细胞在RPMI1640完全培养基中培养0.5小时，然后加入LPS继续培养5小时，然后取培养细胞用Trizol试剂盒提取总RNA。

优选的是：所述的RPMI1640完全培养基为RPMI+10％胎牛血清。

优选的是：所述RT-PCR方法过程为：先取总RNA 3μL加入适量Oligo(dT)、dNTP、10×buffer(RAV)、RNasin、AMV反转录酶，42℃作用1小时，合成IL-10cDNA；然后取cDNA2μL加入适量P1、P2、dNTP、10×buffer、ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，反应条件为95℃预加热5min，然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸10min，扩增结束后取5μL混合物用2％琼脂糖凝胶电泳。

优选的是：用RT-PCR方法生产的产物需要进行酶切鉴定，鉴定过程如下：取50μL PCR产物用1％低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段，悬溶于30μL TE溶液，取8μL用EcoRV酶切鉴定。

优选的是：所述的克隆pIL-10基因过程为：取PCR回收产物用BamHI和HindIII双酶切，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段，pUC18同样用BamHI和HindIII双酶切回收纯化，取酶切处理的1μL pUC18质粒、4μL IL-10PCR产物、1μL T4 DNA连接酶和1μL 10×连接酶buffer，16℃进行12小时连接反应，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，提取质粒。

优选的是：克隆之后需要进行克隆鉴定及序列测定，将提取的质粒用BamHI和HindIII双酶切和PCR分别鉴定并筛选阳性克隆。

本发明的有益效果为：猪疫苗中与抗原同时注射或预先注射细胞因子可明显增强机体产生针对该抗原的免疫应答。白介素PIL-10作为一种理想的抗炎因子，一方面抑制炎性细胞的激活、迁移与粘附；另一方面抑制炎症因子的合成与释放。用此种制备方法制成的白介素PIL-10对免疫系统的作用主要是抑制细胞免疫直接或间接抑制T淋巴细胞的增殖与成熟；上调体液免疫一促进B淋巴细胞的增殖、成熟及抗体的分泌，用本发明提供的方法制备PIL-10制备过程简单，作为佐剂应用到猪疫苗中有很好的免疫效果。

附图说明

图1为本发明p10/pPROEXHTb的构建示意图

具体实施方式